Гликолиз начинается с одной молекулы глюкозы. С помощью ATФ, фермент гексокиназа передаёт фосфатную группу шестиуглеродному сахару для получения глюкозы 6-фосфата, который оказывается зажат внутри клетки из-за его отрицательного заряда. Далее, фермент фосфоглюкоизомераза катализирует преобразование фосфоглюкозы в один из её изомеров, фруктозу 6-фосфат.Фосфо-фруктозу теперь можно фосфорилировать при помощи фермента с ограничением скорости, фосфоруктокиназы, для получения фруктозы 1, 6-бисфосфата. Наконец, с присоединением двух фосфатных групп, молекула сахара расщеплена альдолазой на два трёхуглеродных изомера, глицеральдегид 3-фосфат или Г3Ф, и дигидроксиацетон-фосфат, DHAP. Другой катализирующий фермент, триозофосфат изомераза, преобразует DHAP в G3P для получения двух молекул.Таким образом, на этом этапе вклада энергии, в общей сложности используется две ATФ для разделения одной начальной молекулы глюкозы на два более мелких сахара.