In-vitro Mutajenez

Bir genin işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için, araştırmacılar genetiği değiştirilmiş nakavt hayvanlar oluşturarak gen inaktive veya “nakavt” durumları gözlemleyebilirler. Nakavt fareler, kanser, Parkinson hastalığı ve diyabet gibi insan hastalıkları için özellikle faydalı modeller olmuştur.

Süreç

Genler rastgele nakavt edilebilir veya belirli genler hedeflenebilir. Belirli bir geni yok etmek için, hedef vektör adı verilen tasarlanmış bir DNA parçası normal genin yerini alır ve bu da geni etkisiz hale getirmek için kullanılır.

Hedefleme vektörlerinin her iki ucunda, ilgi geninin her iki tarafını çevreleyen dizilerle özdeş veya homolog diziler vardır. Bu homolog diziler, hedefleme vektörüne, miyoz sırasında benzer dizilerle DNA arasında doğal olarak oluşan homolog rekombinasyon yoluyla genin yerini almasına olanak sağlar.

Hedefleme vektörü, elektroporasyon (hücre zarında geçici olarak gözenekler oluşturmak için elektrik darbelerinin kullanılması) gibi yöntemler kullanılarak kültürdeki fare embriyonik kök hücrelerine sokulur. Tipik olarak, vektörün geni düzgün bir şekilde değiştirdiği hücreleri tanımlamak için, homolog bölgeler arasında neomisin direnci (Neo^R)— geni gibi pozitif bir seçim belirteci ve homolog bölgelerden sonra viral timidin kizaz (TK) geni gibi negatif bir seçim belirteci içerecek şekilde tasarlanırlar.

Hücreler neomisine maruz bırakılırlar ve sadece vektörü DNA'larına dahil olanlar hayatta kalırlar çünkü bu hücreler Neo^R genine sahiptirler. Ayrıca, vektörün homolog rekombinasyon yoluyla hedeflenen genin yerini aldığı hücreler, TK genine sahip olmadıklarından gansiklovir ilacı varlığında hayatta kalabilirler. Bu nedenle vektörü rastgele şekilde genomlarına ekleyen hücreler, TK genine sahip olduklarından gansiklovir maruziyeti ile yok edilebilirler.

Geni düzgün bir şekilde nakavt edilen hücreler daha sonra bir fare embriyosuna yerleştirilir, ve ardından bu embriyo bir dişinin rahmine yerleştirilir ve doğuma kadar gelişir. Ortaya çıkan fare bir kimeradır, yani bazı hücreleri embriyodan gelen normal DNA’ları içerirken, bazı hücreleri ise gen vakavt kromozom parçaları içerir. Bu fareler yetiştirilir ve ilgili geni içeren yavrular, her hücrenin nakavt için homozigot olduğu bir fare hattı oluşturmak için birbiriyle çaprazlanırlar. Bu nakavt fareler daha sonra gen fonksiyonu çalışmak için kullanılabilir.