체외 돌연변이유도

유전자의 기능에 대해 더 배우기 위해 과학자들은 유전적으로 조작된 유전자제거(knock-out; 넉아웃) 동물을 만들어 유전자가 활성화되지 않거나 “넉아웃”되었을 때 어떤 일이 일어나는지 관찰할 수 있습니다. 유전자제거 쥐는 특히 암, 파킨슨병, 그리고 당뇨병과 같은 인간 질병의 모델로 유용합니다.

과정

유전자는 무작위로 제거되거나 특정 유전자가 표적(target)이 될 수 있습니다. 특정 유전자를 없애려면 타겟팅 벡터(targeting vector)라고 불리는 유전자 조작된 DNA 조각을 사용해 정상 유전자를 대체해 해당 유전자를 비활성화합니다.

타겟팅 벡터는 각 말단에 관심 유전자(gene of interest)의 양쪽에 인접한 서열와 동일하거나 상동적(homologous)인 서열을 가지고 있습니다. 이러한 상동적 서열은 타겟팅 벡터가 상동재조합(homologous recombination)을 통해 관심 유전자를 대체할 수 있도록 합니다 (상동재조합은 감수분열(meiosis) 중 유사한 서열을 가진 DNA 사이에서 자연적으로 발생하는 과정입니다).

타겟팅 벡터는 배양 중인 쥐 배아 줄기세포(embryonic stem cell)에 전기천공법(electroporation; 전기 충격을 통해 세포막에 일시적으로 구멍을 만드는 것)과 같은 방법을 사용하여 도입됩니다. 일반적으로, 벡터가 유전자를 적절하게 대체한 세포를 식별하기 위해, 상동 영역 사이에 네오마이신(neomycin) 내성 유전자(Neo^R)와 같은 양성 선택 표지자(positive selection marker)와 바이러스 티미딘인산화효소(viral thymidine kinase, 줄여서 TK)와 같은 음성 선택 표지자(negative selection marker)를 포함하도록 설계됩니다.

세포들은 네오마이신에 노출되고, DNA에 벡터를 통합한 세포만이 Neo^R 유전자 때문에 살아남습니다. 또한, 벡터가 상동재조합을 통해 관심 유전자를 대체한 세포는 TK 유전자를 가지고 있지 않아 간시클로버(ganciclovir)에 노출되어도 생존합니다. 이때 간시클로버는 벡터가 유전체에 무작위로 삽입된 세포를 제거하는 데 사용됩니다. 그런 세포는 TK 유전자를 가지고 있기 때문입니다.

유전자가 적절하게 제거된 세포는 쥐 배아에 삽입되고, 쥐 배아는 암컷의 자궁에 착상되어 태어날 때까지 발달합니다. 그렇게 태어난 쥐는 키메라(chimera)로, 일부 세포는 배아에서 정상 DNA를 얻었고, 다른 세포는 유전자 조작된 세포에서 관심 유전자가 제거된 DNA를 얻은 상태입니다. 이 쥐를 번식 시켜 얻은 새끼 중 생식세포에 관심 유전자가 제거된 DNA를 포함하고 있는 새끼를 골라 교차번식을 통해 모든 세포가 제거된 유전자에 동형접합적(homozygous)인 쥐의 계통(line)을 만듭니다. 그러고 나서 이 유전자제거 쥐들을 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.