Мутагенез in vitro

Чтобы узнать больше о функции гена, исследователи могут наблюдать, что происходит, когда ген инактивирован или “выбит”, создавая генетически модифицированных животных методом “нокаута”. Нокауты мышей были особенно полезны в качестве моделей для заболеваний людей, таких как рак, болезнь Паркинсона, и диабет.

Процесс

Гены могут быть случайно выбиты, или конкретные гены могут быть выбраны специально. Чтобы выбить определенный ген, специально смоделированный кусок ДНК, называемый вектором таргетинга, используется для замены нормального гена, тем самым инактивируя его.

Векторы таргетинга имеют последовательности на каждом конце, идентичные или гомологичные, к последовательностям, фланговым каждой стороне интересующего гена. Эти гомологичные последовательности позволяют вектору таргетинга заменить ген через гомологичную рекомбинацию – процесс, который естественным образом возникает между ДНК с аналогичными последовательностями во время мейоза.

Направляющий вектор вводят в эмбриональные стволовые клетки мыши в культуре с использованием таких методов, как электропорация – использование электрических импульсов для временного создания пор в клеточной мембране. Обычно для идентификации клеток, в которых вектор должным образом заменен геном, его конструируют для включения маркера положительной селекции & mdash; такого как ген устойчивости к неомицину (Neo ^R ) & mdash; между гомологичными областями; и маркер отрицательной селекции, такой как ген вирусной тимидинкиназы (ТК), после одной из гомологичных областей.

Клетки подвергаются действию неомицина, и выживут только те клетки, которые включили вектор в свою ДНК, поскольку они имеют ген Neo ^R . Кроме того, клетки, в которых вектор заменил ген-мишень посредством гомологичной рекомбинации, не будут иметь гена TK, что позволит им выжить в присутствии препарата ганцикловира. Поэтому воздействие ганцикловира используется для уничтожения клеток, в геном которых случайным образом вставлен вектор, поскольку эти клетки будут иметь ген TK.

Клетки с правильно выбитым геном затем вставляются в эмбрион мыши, который имплантируется в матку самки, где он развивается до рождения. Полученная мышь представляет собой химеру, что означает, что она состоит из смеси клеток, некоторые из которых имеют нормальную ДНК эмбриона, а некоторые – ген, выбитый на одной хромосоме из созданных клеток. Этих мышей разводят, и потомство, содержащее ген в их зародышевой линии, затем скрещивают, чтобы создать линию мышей, в которой каждая клетка гомозиготна по нокауту. Затем этих мышей с нокаутом можно использовать для изучения функции генов.