Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie

General Laboratory Techniques
 

Summary

Ein Fluoreszenzmikroskop ist ein sehr vielfältiges analytisches Instrument, das die vergrößernden Eigenschaften der Lichtmikroskopie mit der auf Fluoreszenz basierenden Visualisierung kombiniert. Fluoreszenz ist ein Phänomen, das auf der Absorbanz und Emission eines kleinen Wellenlängenbereiches von einem fluoreszierenden Molekül, auch Fluorochrome genannt, beruht. Ein Fluoreszenzmikroskop besteht aus einem einfachen Lichtmikroskop und einer zusätzlichen, starken Lichtquelle mit speziellen Filtern. Außerdem braucht man ein fluoreszierendes Präparat.

Dieses Video beschreibt die einfachen Prinzipien der Fluoreszenzmikrokopie, einschließlich des Mechanismus der Fluoreszenz, Stoke’s Verschiebung, und dem Ausbleichen. Es werden auch zahlreiche Beispiele gezeigt wie Präparate mit fluoreszierenden Farbstoffen gekennzeichnet werden können, beispielsweise mit Antikörpern, die an Fluorochrome gekoppelt sind, mit fluoreszenten Farbstoffen für Nukleinsäuren, und mit autofluoreszenten Proteinen.

Die Hauptbestandteile eines Fluoreszenzmikroskops, also die Xenon oder Quecksilberlampe, der Lichtfilter, der dichroitische Spiegel, und die Benutzung eines Shutters um die Probe zu beleuchten, werden beschrieben. Zum Schluss gehen wir auf einige Beispiele und Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie genauer ein.

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JoVE Science Education Database. Generelle Laborverfahren. Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Fluoreszenz beschreibt das Phänomen bei dem eine Substanz Licht mit einer bestimmten Wellenlänge absorbiert und danach Licht einer anderen Wellenlänge emittiert. Fluoreszenz tritt auf wenn ein Elektron von dem instabilen, angeregten Zustand in den Grundzustand übergeht und dabei ein Photon abgibt. Das Licht, das eine Substanz anregt und dabei das Energieniveau des Elektrons erhöht, hat eine kürzere Wellenlänge und höhere Energie als die fluoreszente Emission, die eine längere Wellenlänge, niedrigere Energie, und eine andere Farbe hat.

Die Fluoreszenzmikroskopie vereint die vergrößernde Eigenschaft der Lichtmikroskopie mit der Fluoreszenztechnologie, die es erlaubt die Anregung und die Emission von Fluorochromen – also fluoreszenten Chemikalien – zu messen. Mit der Fluoreszenzmikroskopie können Wissenschaftler die Position von verschiedenen Zellarten in Geweben oder von bestimmten Molekülen in Zellen anschauen.

Die Hauptbestandteile eines Fluoreszenzmikroskops sind ähnlich derer eines Lichtmikroskops. Es gibt jedoch 2 Hauptunterschiede: die Lichtquelle und die Benutzung von speziellen Filterelementen.

Für die Fluoreszenzmikroskopie braucht man eine Lichtquelle mit hoher Leuchtstärke, zum Beispiel von Xenon oder Quecksilberlampen wie hier gezeigt. Das Licht das von diesen Lampen emittiert wird ist 10-100 Mal heller als das von normalen Glühlampen. Außerdem stellen diese Lampen Licht mit vielen Wellenlängen, von ultraviolett bis infrarot, zur Verfügung. Diese leistungsfähige Lampe ist das gefährlichste Element des Fluoreszenzmikroskops. Wenn man ungefiltertes Licht direkt ins Auge bekommt, kann das die Netzhaut beschädigen. Außerdem kann bei falscher Anwendung die Lampe explodieren.

Die Prinzipien der Fluoreszenzmikroskopie sind einfach. Das Licht der Lampe wird durch einen Anregungsfilter gestrahlt, der die Anregungswellenlänge selektiert.

Das Licht wird dann in Richtung des Präparats auf einen speziellen Spiegel gestrahlt, der auch dichroitischer Spiegel genannt wird, und der nur das Licht der Anregungswellenlänge reflektiert. Das reflektierte Licht passiert dann das Objektiv, wo es auf das fluoreszente Präparat fokussiert wird. Die Emissionen des Präparats werden dann wiederum zurück durch das Objektiv geleitet, wo die Vergrößerung des Bildes stattfindet, und danach durch den dichroitischen Spiegel.

Das Licht wird dann in einem Sperrfilter so gefiltert, das nur die Emissionswellenlänge ausgewählt und das restliche, kontaminierende Licht rausgefiltert wird, das zum Beispiel von der Lampe entsteht oder von anderen Quellen, die vom Mikroskop reflektiert werden. Dann wird die gefilterte, fluoreszente Emission zu einem Detektor geleitet mit dem das Bild digitalisiert wird, oder durch das Okular für die optische Darstellung.

Die Anregungsfilter, dichroitische Spiegel und Sperrfilter können zu einer Filtereinheit zusammengebaut werden. Verschiedene Filtereinheiten können beim Anschauen des Präparates ausgewechselt werden, um die Anregungswellenlänge zu ändern. Eine Reihe von Blenden können verwendet werden um die Intensität der Anregung zu regulieren.

Bei der Fluoreszenzmikroskopie ist das Fluorochrome genauso wichtig wie das Mikroskop selbst. Das Fluorochrome bestimmt die Anregungswellenlänge, die benutzt wird und die Emissionswellenlänge, die aufgenommen wird. Die Anregungswellenlängen haben eine kleine Spanne von Energien, die von dem Fluorochrome absorbiert werden können, damit es in den angeregten Zustand übergeht. Wenn das Fluorochrome erstmal angeregt ist, sind eine große Anzahl von Übergängen in den Grundzustand möglich, was zu einem Emissionsspektrum führt.

Der Unterschied zwischen dem Maximum der Absorptions-oder Anregungskurve und dem Maximum der Emissionskurve nennt man Stoke’s-Verschiebung. Je größer die Entfernung dieser Verschiebung, je einfacher ist es die verschiedenen Wellenlängen voneinander zu trennen. Außerdem sollten die überlappenden Spektra durch die Filtereinheit entfernt werden, um das Hintergrundsignal zu reduzieren und die Bildqualität zu erhöhen.

Die lange Belichtung des Fluorochroms mit der Anregungswellenlänge führt zur Ausbleichung, was zu einer Abschwächung oder dem Verlust des Fluorochroms führen kann. Um das Ausbleichen zu verhindern, kann man « Antifade Eindeckmedium» auf den Objektträger auftragen und dann die Ränder mit Nagellack versiegeln. Das Präparat sollte außerdem im Dunklen gelagert werden wenn es nicht gerade zur Mikroskopie verwendet wird.

Um das Fluoreszenzmikroskop zu benutzen, macht man zuerst die Xenon oder Quecksilberlampe an und lässt sie für ca 15 Minuten aufwärmen, damit sie ihre konstante Leuchtkraft erreicht.

Danach legt man das Präparat auf den Objekttisch. Dann macht man die Lichtquelle des Mikroskops an. Man fokussiert das Präparat mit der niedrigsten Objektivstärke durch Drehen des Grob- und Feintriebs. Dann benutzt man die Drehknöpfe um den Objekttisch zu bewegen und die Stelle zu finden, die man abbilden möchte.

Nun macht man die Weißlichtquelle und alles andere nicht notwendige Licht aus, um das Hintergrundsignal zu reduzieren. Jetzt sucht man die richtige Filtereinheit aus und öffnet den Schütter um das Präparat zu beleuchten.

Zuletzt sollte man den Fokus neu einstellen und das emittierte Licht an die Kamera leiten. Wahrscheinlich muss man die Belichtungszeit für jedes unterschiedliche Flurochrome oder jeden fluoreszenten Farbstoff neu einstellen. Es ist jedoch wichtig das die Belichtungszeit gleich bleibt, wenn man zwei verschiedene Präparate vergleicht, die den gleichen fluoreszenten Farbstoff haben.

Um das gleiche Präparat mit verschiedenen fluoreszenten Farbstoffen abzubilden, muss man die Filtereinheit wechseln und ein neues Bild aufzeichnen.

Nachdem alle Fluorochromes aufgezeichnet worden sind, kann man die einzelnen Bilder zum Vergleichen übereinander legen.

Viele verschiedene Experimente können Fluoreszenzmikroskopie und verschiedene Fluorochromes beinhalten. Eine der häufigsten Anwendungen von Fluoreszenzmikroskopie ist es Proteine abzubilden, die mit Antikörpern gekennzeichnet sind, die dann wiederum an fluoreszente Moleküle gekoppelt sind. Hier wird ein Antikörper gegen die leptospiral Oberflächenproteine detektiert, welcher dann mit einem sekundären Antikörper gekennzeichnet ist, der an Alexafluor gekoppelt ist und im angeregten Zustand grün fluoresziert.

Ein anderer Weg um ein bestimmte Eigenschaft mit Fluoreszenz darzustellen, ist den Code für ein fluoreszentes Protein in die DNA eines Organismus zu integrieren. Das Gen für das grün fluoreszierende Protein, oder GFP, ist ursprünglich von einer Qualle isoliert worden und kann von kultivierten Zellen als Reaktion auf verschiedene Trigger oder als Teil einer spezifischen Zellart exprimiert und produziert werden. Hier sind zum Beispiel Tumorzellen zu sehen, die grün fluoreszieren.

Eine andere Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie ist die Fluoreszenz Speckle Mikroskopie, bei der makromolekulare Ansammlungen zum Beispiel von F-Aktin Netzwerken, die hier gezeigt werden, untersucht werden. Dadurch können die Bewegung und Umsatzkinetik diese wichtigen Zytoskeletonproteins untersucht werden.

Eine fortgeschrittene Technik ist Fluoreszenz Recovery after Photobleaching, oder FRAP, bei der man absichtlich eine kleine Region des Präparats ausbleicht um die Diffusionsrate der mit Fluoreszenz gekennzeichneten Moleküle in der gebleichten Region zu messen.

Das war die Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie von JoVE. In diesem Video haben wir die Konzepte der Fluoreszenz gelernt, wie Fluoreszenzmikroskopie funktioniert, wie Fluoreszenzmikroskope sich von Lichtmikroskopen unterschieden, und wie man ein Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop aufnimmt. Außerdem haben wir uns einige fortgeschrittene Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie angeschaut. Danke für eure Aufmerksamkeit und denkt daran das Bleichen vielleicht gut für die Zähne aussieht, aber nicht für eure Präparate.

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