鸡胚的壳內电转化

Biology II

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Summary

电转化是应用在生物医学研究中的技术,它通过将外源基因物质导入到细胞中来改变基因的表达。更确切地说,壳內电转处理的是蛋壳内的早期发育中的小鸡胚胎。在该过程中,先将DNA或敲除载体注射到目的组织中。然而,遗传物质不能穿透胞膜进入细胞内行使功能。为解决这个问题,可施加一个电场暂时破坏胞膜的完整性。该电场还会造成带负电荷的核酸穿过胞膜上的小孔向正电极迁移,因此有效地将DNA或敲除载体引入了细胞内。该技术的主要优点是可将遗传物质的导入定位到某个特定发育时期的特定组织中。这样就可研究操控某个发育事件的遗传机制。

本短片概述了壳內电转的原理,介绍了该技术要用到的工具,包括毛细针,电极和电转 仪。还演示了该过程的逐步操作,接着讨论了如何利用该技术在鸡胚中进行多种遗传操作的几个有趣例子。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 模式生物II:小鼠,斑马鱼和鸡. 鸡胚的壳內电转化. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

电转化是一种将外源基因物质引入到细胞的技术。对鸡蛋内的鸡胚进行电转,或称壳內电转化,可将遗传物质的导入定位到某个特定发育时期的特定组织中,因而是一个对发育生物学家及其有价值的工具。本短片将介绍壳內电转的基本原理,描述该过程的主要步骤,并讨论如何将该技术应用于研究发育中的生物进程。

首先,让我们来回顾一下电转的基本原理,以了解它是如何将DNA导入细胞。

第一,显微注射用于将DNA输送到我们感兴趣的细胞的附近。然而,DNA并不能穿透胞膜进入细胞。

为解决这一问题,可施加电流在胞膜上穿孔,破坏其完整性。该电场的另一个结果是造成带负电荷的DNA向正电极方向迁移。因此,只有处于注射位置并离正电极近的细胞能被DNA转化。

现在您知道了基本原理,让我们来谈谈如何准备胚胎用于电转。如果您要用到晚于Hamburger Hamilton第20期的胚胎,为了方便接触到组织,最好是将鸡胚在蛋壳外进行去壳培养。本短片将着重讲述对蛋壳内发育的早期胚胎,也就是壳內的电转化。

首先,鸡蛋要孵育在湿润的孵育箱中37度培养直至达到想要的发育阶段。孵育鸡蛋期间,可准备用于注射和电转的工具。先用拉针仪拉0.5毫米的玻璃吸管来制作毛细针。将其放在显微镜下,切断顶端的一小段来将吸管打开。再准备注射用的溶液,它必须含合适浓度的载体和帮助观察注射溶液的染料。

为控制针内液体的移动,可将它接在一个人工的嘴吸球上,也可将它装在一个能提供可调控的气流压力的显微注射仪上。将针尖浸没在注射溶液中,施加负压来使液体充满针内。

除了注射针外,您还需要电极。它包括固定在一个转化器上的两个裸露的电线。用一对导线将两个电极连接到电脉冲发生器,就是电转仪上,它能控制脉冲的持续时间,频率和电压。电转仪还可通过脚踏板来控制,无需手进行操作。

当鸡蛋准备好后,在蛋壳上开一个窗口,加入几滴生理盐水,如hanks溶液,来防止胚胎干掉。在显微镜下摆放鸡蛋,使感兴趣的组织处于注射针能到达的位置。然后用毛细针刺破胚胎,轻轻施压将溶液注入。

现在我们已经注射了载体,再该来进行电转了。将电极浸没在Hank's溶液中,并使得感兴趣的组织位于两个电极的中间。踩下踏脚板施加电流,在电极周围应该会看到有气泡出现。

电转化完成后,从胚胎中取出电极,用70% 酒精擦拭。向胚胎中滴几滴含抗生素的盐溶液来避免感染,再用胶带密封窗口。最后,将鸡蛋放回孵育箱使其在做表型分析前继续发育。

现在我们学习了所有壳內电转的内容。我们再来看看科学家们如何将该技术应用到发育学研究中的一些例子。

首先,电转可以用来导入敲除载体来阻断基因的表达。在这个例子中,发育中神经管的细胞被电转入了基因沉默载体。将胚胎继续发育,比较正常样本和敲除样本中的轴突轨迹,可以评估轴突导向中的基因调控。

反过来,壳內电转还可用来在一部分细胞中表达蛋白,通过引入含编码蛋白基因或启动子的质粒,启动子是起始转录的一段结合RNA聚合酶序列。这里,科学家们向胚胎脑部的细胞中引入了一个基因。用组织染色来检测该基因的蛋白产物和特定神经亚型的标记物,可以说明该电击转入的基因改变了神经发育。

编码荧光蛋白的DNA载体也可通过电击转入来帮助观察发育过程中的细胞和结构。这使得能对复杂的生物进程,如脊髓发育,进行活体成像,让我们了解细胞随时间迁移的动态过程。

您刚观看的是JoVE对壳內电转的介绍,它是一种将遗传物质导入到鸡胚中的有用技术。本短片讨论了电转的基本原理,注射和电转鸡胚的所需步骤,以及该技术在现代发育学研究中的应用。感谢观看!

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