אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת במחקר ביו-רפואי המאפשרת מניפולציה של ביטוי גנים באמצעות אספקת חומר גנטי זר לתאים. ליתר דיוק, ב ovo electroporation מבוצע על אפרוחים מתפתחים מוקדם(גאלוס גאלוס ביתיות)הכלול בתוך קליפות הביצים שלהם. בהליך זה, DNA או מבנים נוקאאוט מוזרקים תחילה לתוך רקמת היעד. עם זאת, החומר הגנטי אינו מסוגל לחדור את קרום הפלזמה כדי לבצע את תפקידו בתוך התא. כדי לפתור בעיה זו, שדה חשמלי מוחל, גרימת שיבושים זמניים ליציבות הממברנה. שדה חשמלי זה גורם גם לחומצות הגרעין הטעונות השליליות לנדוד לכיוון האלקטרודה הטעונה באופן חיובי דרך החורים בקרום הפלזמה, ובכך למעשה מניע את ה- DNA או את מבנה ההפלה לתא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי משלוח של חומר גנטי יכול להיות מקומי לסוגי תאים מבודדים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות. כתוצאה מכך, ניתן לבחון את המנגנונים הגנטיים השולטים באירועים התפתחותיים בודדים.
וידאו זה מספק סקירה של העקרונות שמאחורי האלקטרופורציה של ovo ומציג את הכלים הדרושים לטכניקה, כולל מחטים נימיות, אלקטרודות ואלקטרופורטור. פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ההליך מוצג גם לפני הדיון בכמה דוגמאות מרתקות לאופן שבו הטכניקה משמשת לביצוע מגוון מניפולציות גנטיות בעוברי תרנגולות.
אלקטרופורציה היא טכניקה המשמשת להכנסת חומר גנטי זר לתאים. אלקטרופורציה של עוברים אפרוח בתוך הביצה, או אלקטרופורציה ovo, הוא כלי בעל ערך עבור ביולוגים התפתחותיים כי משלוח של חומר גנטי יכול להיות מקומי לרקמות ספציפיות ונקודות זמן התפתחותיות ספציפיות. וידאו זה יציג את העקרונות הבסיסיים של אלקטרופורציה ovo, לתאר צעדים חיוניים של ההליך, ולדון כיצד טכניקה זו יכולה לשמש כדי ללמוד תהליכים ביולוגיים במהלך הפיתוח.
בתור התחלה, בואו נסקור את העקרונות הבסיסיים של אלקטרופורציה כדי להבין איך זה יכול לשמש כדי לקבל DNA לתוך תא.
ראשית, מיקרו-ינון משמש להעברת הדנ”א בסמיכות לתא מעניין. עם זאת, הדנ”א לא יכול לחדור את קרום הפלזמה כדי להיכנס לתא.
כדי לפתור בעיה זו, זרם חשמלי מוחל כדי לשבש את היציבות של הממברנה, יצירת נקבוביות. תוצאה שנייה של שדה חשמלי זה היא נדידת הדנ”א הטעון השלילית לכיוון האלקטרודה החיובית. כתוצאה מכך, רק תאים בצד של אתר ההזרקה קרוב יותר אלקטרודה חיובית להיות transfected עם ה- DNA.
עכשיו שאתם יודעים את העקרונות הבסיסיים, בואו נדבר על איך להכין עוברים לאלקטרופורציה. אם אתה צריך להשתמש בעוברים מבוגרים יותר המבורגר המילטון שלב 20, עדיף לתרבות האפרוחים שלך מחוץ הקליפה, או ex ovo, עבור גישה משופרת לרקמות. וידאו זה יתמקד אלקטרופורציות המבוצעות על עוברים מוקדמים המתפתחים בתוך הקליפה, או באובו.
בתור התחלה, ביצים צריך להיות דגירה באינקובטור לח ב 37 °C (50 °F) עד שהם הגיעו לשלב ההתפתחות הרצוי. בזמן שהביצים מדגרות, הכינו את הכלים להזרקה ואלקטרופורציה. ראשית, לעשות מחטים נימיות על ידי משיכת צינור זכוכית 0.5 מ”מ עם מושך צינור. כדי לפתוח את הצינור, מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ ושוברים חתיכה קטנה מהקצה. לאחר מכן, להכין את פתרון ההזרקה, אשר צריך להכיל דילול מתאים של המבנה שלך, כמו גם צבע כדי לעזור לך לדמיין את הפתרון המוזרק.
כדי לשלוט בתנועת הנוזל בתוך המחט, חבר אותו לצינור פה המופעל על ידי אדם. לחלופין, ניתן לטעון את המחט על מיקרו-נג’ר, המספק פולסים מתכווננים של אוויר. מלא את המחט על ידי טביעת הקצה בתמיסת ההזרקה והחלת לחץ שלילי.
בנוסף למחטים, תצטרך גם אלקטרודות. אלה מורכבים משני חוטים חשופים קבועים יחד על ידי מתאם. זוג כבלים מחבר את האלקטרודות למחולל הפעימות החשמלי, או אלקטרופורטור, השולט על משך הדופק, התדירות והמתח. עבור פעולה ללא ידיים, האלקטרופורטור יכול להיות מופעל על ידי דוושת רגל.
לאחר הביצים מוכנות, לחתוך חלון בקליפה, ולהוסיף כמה טיפות של תמיסת מלח פיזיולוגית, כגון הנקס, כדי למנוע את העובר להתייבש. תחת מיקרוסקופ, למקם את הביצה כך רקמת העניין נגיש המחט. לאחר מכן, לנקב את העובר עם המחט נימי ולספק את הפתרון על ידי הפעלת לחץ עדין.
עכשיו שהזרקנו את המבנה, הגיע הזמן לבצע את האלקטרופורציה. מקם את האלקטרודות כך שהן שקועות בתמיסה של האנק ורקמת העניין מרוכזת ביניהן. על מנת ליישם את הזרם החשמלי, לחץ על דוושת כף הרגל וחפש בועות היוצרות סביב האלקטרודות.
לאחר האלקטרופורציה הושלמה, להסיר את האלקטרודות מן העובר ולנגב אותם עם 70% אתנול. מוסיפים כמה טיפות של תמיסת מלח בתוספת אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום, ולאטום את החלון עם סרט הדבקה. לבסוף, מניחים את הביצים בחזרה באינקובטור להמשך הפיתוח לפני ניתוח פנוטיפי.
עכשיו שלמדנו הכל על אלקטרופורציה ovo, בואו נסתכל על כמה דוגמאות של איך מדענים מיישמים טכניקה זו במחקר התפתחותי.
בתור התחלה, אלקטרופורציה יכולה לשמש כדי לחסום ביטוי גנים על ידי משלוח של מבנים נוקאאוט. בדוגמה זו, תאים של הצינור העצבי המתפתח היו אלקטרופורציה עם מבנים השתקת גנים. העוברים הורשו להתפתח, ואז הושוו מסלולי אקסון בין דגימות רגילות ונוק-דאון כדי להעריך את השליטה הגנטית של הדרכת אקסון.
מצד שני, ב ovo electroporation יכול לשמש גם כדי לבטא חלבון בתת קבוצה של תאים על ידי החדרת plasmid המכיל גן קידוד חלבון ומקדם: רצף אשר קושר RNA פולימראז ליזום שעתוק. כאן, מדענים העבירו גן אחד לתאים של המוח העוברי. כתמי רקמות כדי לזהות הן את מוצר החלבון של גן זה והן סמנים של תת-סוגים עצביים ספציפיים מראה כי הגן האלקטרופורציה משנה את ההתפתחות העצבית.
DNA בונה קידוד חלבונים פלואורסצנטיים יכול להיות הציג גם על ידי אלקטרופורציה כדי לדמיין תאים ומבנים במהלך הפיתוח. זה מאפשר הדמיה חיה של תהליכים מורכבים, כגון פיתוח חוט השדרה, מתן תובנה על הדינמיקה של תנועות התא לאורך זמן.
הרגע צפית בהקדמה של JoVE לאלקטרופורציה של אובו, טכניקה שימושית להעברת חומר גנטי לאפרוחים. וידאו זה דן בעקרונות הבסיסיים של אלקטרופורציה, צעדים הנדרשים להזרקה אלקטרופורציה אפרוחים, ויישומים של טכניקה זו במחקר ההתפתחותי הנוכחי. תודה שצפיתם!
Electroporation is a technique used to introduce foreign genetic material into cells. Electroporation of chick embryos inside the egg, or in ovo electroporation, is a valuable tool for developmental biologists because the delivery of genetic material can be localized to specific tissues and specific developmental time points. This video will introduce the basic principles of in ovo electroporation, describe essential steps of the procedure, and discuss how this technique can be used to study biological processes during development.
To start, let’s review the basic principles of electroporation to figure out how it can be used to get DNA into a cell.
First, microinjection is used to deliver the DNA in close proximity to a cell of interest. However, the DNA can’t penetrate the plasma membrane to get into the cell.
To solve this problem, an electrical current is applied to disrupt the stability of the membrane, creating pores. A second consequence of this electric field is the migration of the negatively charged DNA towards the positive electrode. As a result, only cells on the side of the injection site closer to the positive electrode become transfected with the DNA.
Now that you know the basic principles, let’s talk about how to prepare embryos for electroporation. If you need to use embryos older than Hamburger Hamilton stage 20, it’s best to culture your chicks outside of the shell, or ex ovo, for improved tissue access. This video will focus on electroporations performed on early embryos developing within the shell, or in ovo.
To begin, eggs should be incubated in a humidified incubator at 37 °C until they have reached the desired developmental stage. While the eggs are incubating, prepare the tools for injection and electroporation. First, make capillary needles by pulling a 0.5 mm glass pipet with a pipet puller. To open the pipet, place it under a microscope and break off a small piece of the tip. Then, prepare the injection solution, which should contain an appropriate dilution of your construct as well as a dye to help you visualize the injected solution.
To control the movement of fluid within the needle, attach it to a human-powered mouth pipet. Alternatively, the needle can be loaded onto a microinjector, which provides adjustable pressure pulses of air. Fill the needle by submerging the tip in the injection solution and applying negative pressure.
In addition to needles, you’ll also need electrodes. These consist of two exposed wires fixed together by an adaptor. A pair of cables connects the electrodes to the electric pulse generator, or electroporator, which controls the pulse duration, frequency, and voltage. For hands free operation, the electroporator can be activated by a foot pedal.
Once the eggs are ready, cut a window in the shell, and add a few drops of physiological salt solution, such as Hanks, to prevent the embryo from drying out. Under a microscope, position the egg such that the tissue of interest is accessible to the needle. Then, pierce the embryo with the capillary needle and deliver the solution by applying gentle pressure.
Now that we’ve injected the construct, it’s time to perform the electroporation. Position the electrodes so that they are submerged in the Hank’s solution and the tissue of interest is centered between them. In order to apply the electrical current, press the foot pedal and look for bubbles forming around the electrodes.
Once the electroporation is complete, remove the electrodes from the embryo and wipe them down with 70% ethanol. Add a few drops of salt solution supplemented with antibiotics to prevent infection, and seal the window with tape. Finally, place the eggs back in the incubator for continued development prior to phenotypic analysis.
Now that we’ve learned all about in ovo electroporation, let’s look at some examples of how scientists are applying this technique in developmental research.
To begin, electroporation can be used to block gene expression by delivery of knockdown constructs. In this example, cells of the developing neural tube were electroporated with gene silencing constructs. The embryos were allowed to develop, and then axon trajectories were compared between normal and knockdown samples to assess the genetic control of axon guidance.
On the flipside, in ovo electroporation can also be used to express a protein in a subset of cells by introducing a plasmid containing a protein-encoding gene and a promoter: a sequence which binds RNA polymerase to initiate transcription. Here, scientists delivered a single gene into cells of the embryonic brain. Tissue staining to detect both the protein product of this gene and markers of specific neural subtypes shows that the electroporated gene alters neural development.
DNA constructs encoding fluorescent proteins can also be introduced by electroporation to visualize cells and structures during development. This allows for live imaging of complex processes, such as spinal cord development, giving insight into the dynamics of cell movements over time.
You’ve just watched JoVE’s introduction to in ovo electroporation, a useful technique for delivering genetic material into chicks. This video discussed the basic principles of electroporation, steps required to inject and electroporate chicks, and applications of this technique in current developmental research. Thanks for watching!
Related Videos
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
91.8K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
61.5K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
77.5K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
44.4K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
13.8K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
24.1K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
57.6K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
84.2K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
99.7K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
89.0K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
24.8K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
56.8K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
40.0K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
18.5K Views
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
53.7K Views