De ovo Electroporación de embriones de pollo

Biology II

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Summary

La electroporación es una técnica utilizada en la investigación biomédica que permite la manipulación de la expresión génica mediante la entrega de material genético extraño en las células. Concretamente, se realiza en ovo electroporación en pollitos en desarrollo tempranos (domesticus del Gallus de gallus) dentro de sus cáscaras de huevo. En este procedimiento, ADN o derribo de construcciones primero se inyecta en un tejido diana. Sin embargo, el material genético es incapaz de penetrar la membrana del plasma para llevar a cabo su función dentro de la célula. Para resolver este problema, se aplica un campo eléctrico, causando interrupciones temporales para la estabilidad de la membrana. Este campo eléctrico también provoca que los ácidos nucleicos cargados negativamente que migran hacia el electrodo cargado positivamente a través de los agujeros en la membrana plasmática, así con eficacia conduciendo el ADN o construcción de precipitación en la célula. La principal ventaja de esta técnica es que la entrega de material genético puede ser localizada a tipos de la célula aislada en momentos específicos de desarrollo. Como resultado, pueden examinarse los mecanismos genéticos que rigen los acontecimientos individuales del desarrollo.

Este video ofrece una visión general de los principios de electroporación de ovo y presenta las herramientas necesarias para la técnica, incluyendo agujas capilares, electrodos y un electroporator. También se presenta un protocolo paso a paso para llevar a cabo el procedimiento antes de la discusión de algunos fascinantes ejemplos de cómo la técnica se utiliza para realizar una variedad de manipulaciones genéticas en embriones de pollo.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Biology II: Ratón, pez cebra y polluelo. De ovo Electroporación de embriones de pollo. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La electroporación es una técnica utilizada para introducir material genético extraño en las células. Electroporación de embriones dentro del huevo o de ovo electroporación, es una herramienta valiosa para los biólogos del desarrollo porque la entrega de material genético se puede localizar en tejidos específicos y puntos de tiempo específicos de desarrollo. Este vídeo introduce los principios básicos de la electroporación en ovo , describir pasos esenciales del procedimiento y discutir cómo se puede utilizar esta técnica para estudiar procesos biológicos durante el desarrollo.

Para empezar, vamos a repasar los principios básicos de la electroporación para averiguar cómo puede utilizarse para obtener DNA en una célula.

En primer lugar, microinyección utiliza para entregar el ADN en proximidad cercana a una celda de interés. Sin embargo, el ADN no puede penetrar la membrana plasmática en la célula.

Para resolver este problema, se aplica una corriente eléctrica para perturbar la estabilidad de la membrana, creando poros. Una segunda consecuencia de este campo eléctrico es la migración del ADN cargado negativamente hacia el electrodo positivo. Como resultado, solamente las células en el sitio de inyección más cercano para el electrodo positivo ser transfectadas con el ADN.

Ahora que conoces los principios básicos, vamos a hablar de cómo preparar los embriones para la electroporación. Si usted necesita utilizar embriones mayores de la etapa 20 de la hamburguesa de Hamilton, es mejor a sus chicas fuera de la cáscara, o ex ovo, acceso mejorado del tejido de la cultura. Este video se centrará en electroporations realizado en embriones tempranos dentro de la concha, o de ovo.

Para empezar, los huevos deben ser incubados en un incubador humedecido a 37 ° C hasta que hayan alcanzado la etapa de desarrollo deseada. Mientras están incubando los huevos, preparar las herramientas para la inyección y electroporación. En primer lugar, hacer agujas capilares tirando una pipeta de vidrio de 0,5 mm con un tirador de la pipeta. Para abrir la pipeta, colocar bajo un microscopio y romper un pedazo pequeño de la punta. A continuación, preparar la solución de la inyección, que debe contener una dilución de su construcción, así como un tinte para ayudar a visualizar la solución inyectada.

Para controlar el movimiento del líquido dentro de la aguja, conéctelo a una pipeta de boca de propulsión humana. Alternativamente, la aguja se puede cargar en un microinyector, que proporciona pulsos de presión de aire. Llenar la aguja sumergiendo la punta en la solución de la inyección y aplicar presión negativa.

También necesitarás además de agujas, electrodos. Éstos consisten en dos alambres expuestos fijados junto con un adaptador. Un par de cables conecta los electrodos al generador de impulsos eléctricos o electroporator, que controla la duración del pulso, la frecuencia y el voltaje. Para la operación libre de las manos, el electroporator puede ser activado por un pedal.

Una vez que los huevos están listos, cortar una ventana en la cáscara y añadir unas gotas de solución salina fisiológica, como madejas, para evitar que el embrión de la desecación. Bajo el microscopio, coloque el huevo, que es accesible a la aguja el tejido de interés. Luego perforar el embrión con la aguja capilar y ofrecer una solución mediante la aplicación de presión suave.

Ahora que hemos inyectado la construcción, es tiempo para realizar la electroporación. Coloque los electrodos que están sumergidos en solución de Hank y el tejido de interés está centrado en el entre ellos. Para aplicar la corriente eléctrica, presione el pedal de pie y mirar a las burbujas que se forman alrededor de los electrodos.

Una vez completada la electroporación, retirar los electrodos del embrión y limpie con etanol al 70%. Añadir unas gotas de solución salina suplementada con antibióticos para prevenir la infección y sellar la ventana con cinta adhesiva. Por último, vuelva a colocar los huevos en la incubadora para desarrollo continuo antes del análisis fenotípico.

Ahora que hemos aprendido todo acerca de ovo electroporación, echemos un vistazo a algunos ejemplos de cómo los científicos están aplicando esta técnica en la investigación del desarrollo.

Para empezar, electroporación puede utilizarse para bloquear la expresión del gen por la entrega de construcciones de precipitación. En este ejemplo, las células del tubo neural en desarrollo eran electroporated con construcciones de silenciamiento del gen. Los embriones se les permitiera desarrollar y luego trayectorias del axón se compararon entre muestras normales y precipitación para evaluar el control genético de la orientación del axón.

En la otra cara, en ovo electroporación puede utilizarse también para expresar una proteína en un subconjunto de las células mediante la introducción de un plásmido que contiene un gen de codificación de proteínas y un promotor: una secuencia que se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción. Aquí, los científicos entregaron un solo gen en las células del cerebro embrionario. Tejido de tinción para detectar tanto el producto de la proteína de este gen y los marcadores de subtipos neuronales específicos muestran que el gen de la electroporated altera el desarrollo neuronal.

Construcciones de ADN que codifican proteínas fluorescentes también se pueden introducir por la electroporación para visualizar las células y estructuras durante el desarrollo. Esto permite la proyección de imagen viva de procesos complejos, tales como el desarrollo de la médula espinal, dando información sobre la dinámica de los movimientos celulares en el tiempo.

Sólo ha visto introducción de Zeus que en ovo electroporación, una técnica útil para la entrega de material genético en pollitos. Este video discute los principios de electroporación, electroporate pollitos y pasos necesarios para inyectar y aplicaciones de esta técnica en la investigación del desarrollo actual. ¡Gracias por ver!

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