Induzierten Pluripotenz

Developmental Biology
 

Summary

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind Körperzellen, die genetisch umprogrammiert wurde, um undifferenzierte Stammzellen bilden. Ähnlich wie embryonale Stammzellen können iPSCs in Kulturbedingungen angebaut werden, die Differenzierung in verschiedene Zelltypen zu fördern. So können iPSCs eine potenziell unbegrenzte Quelle der menschlichen Zelltypen jeglicher Art, ist ein wichtiger Durchbruch auf dem Gebiet der regenerativen Medizin. Jedoch ist weitere Forschung über die Ableitung und Differenzierung der iPSCs vonnöten, diese Zellen in der klinischen Praxis zu benutzen.

Dieses Video stellt zunächst die grundlegenden Prinzipien hinter zellulären Reprogrammierung, und dann zeigt ein Protokoll für die Erzeugung von iPSCs aus differenzierten Maus embryonalen Fibroblasten. Schließlich diskutieren es mehrere Experimente, in denen Wissenschaftler verbessern oder iPSC Generation Techniken.

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JoVE Science Education Database. Grundlagen der Entwicklung Biologie. Induzierten Pluripotenz. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Induzierte pluripotente Stammzellen, wie menschliche embryonale Stammzellen können in fast jede Zelle im Körper zu unterscheiden und daher große Versprechen auf dem Gebiet der regenerativen Medizin.

Humane embryonale Stammzellen oder Zellkulturen, sind aus vor der Implantation Embryonen gewonnen, während ausdifferenzierten somatischen Zellen verwendet werden, um induzierte pluripotente Stammzellen zu erzeugen, die auch als iPSCs bezeichnet werden.

In diesem Video wirst du lernen, über die grundlegenden Prinzipien hinter generieren iPSCs, ein Schritt für Schritt Protokoll zur Pluripotenz in differenzierten Zellen, und einige der vielen nachgelagerten Anwendungen und Änderungen dieses Protokolls zu induzieren.

Beginnen wir mit der Diskussion über die Grundsätze der Generation von iPSCs von somatischer Zelltypen.

Differenzierte Zellen wie Hautzellen oder Neuronen, sind die, deren Schicksal entschieden ist. Sie sind verpflichtet, eine bestimmte Funktion zu erfüllen. Auf der anderen Seite, pluripotente Stammzellen sind die, deren Schicksal nicht entschieden ist, und sie können zu jedem Zelltyp unterscheiden.

Der Prozess der Veränderung der Identität einer bereits differenzierte Zelle in einen pluripotenten Zustand wird zellulären Reprogrammierung bezeichnet. Dies umfasst das Ändern der Muster der Genexpression in der Zelle, weil die Anzahl und Arten von Proteinen durch eine Zelle spielen eine wichtige Rolle bei der Definition einer Zelle Identität produziert.

Eine der Möglichkeiten, induzieren zelluläre Umprogrammierung ist durch Induktion des Ausdrucks bestimmte Transkriptionsfaktoren. Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an regulatorischen Sequenzen innerhalb eines Gens binden. Einige dieser Sequenzen sind "Veranstalter" genannt, und fördern deshalb die Transkription eines Gens. Ein paar Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Expression von zahlreichen Genen, hat einen großen Einfluss auf die Zelle Identität.

Die vier klassischen Transkriptionsfaktoren, die nachgewiesen haben, induzieren Pluripotenz sind Oct4, Sox2, cMyc und Klf4. Diese Faktoren sind auch bekannt als Yamanaka Faktoren nach der Forscher, die ihre Neuprogrammierung Effekte entdeckt.

Mehrere Methoden können Ausdruck dieser Transkription Faktoren induzieren. Die am weitesten verbreitete und effiziente Methode ist die Verwendung eines veränderten Virus übermitteln die Transkription Faktor Gene in den Zellkern, wo sie sich in das Genom integrieren.

Bei dieser Methode werden die Gene, die Codierung der vier Yamanaka Faktoren einzeln verpackt in unterschiedlichen Retroviren und hinzugefügt zu differenzierten Zellen. Wenn die Zellen geändert Viren ausgesetzt sind, ein kleiner Bruchteil von differenzierten Zellen infiziert werden, mit allen vier Transkription Faktor tragen Viren. Sie fangen an Gewebestammzelle bis große sphärische Cluster von pluripotenten Stammzellen gebildet werden. Die Cluster-Bildung hilft iPSCs Erstellen einer Mikroumgebung, die in Vivo Stammzellen ähnlich ist und daher helfen ihnen ihre Pluripotenz zu halten.

Da Sie nun die grundlegenden Prinzipien hinter der Generation iPSCs verstehen, gehen Sie wir durch ein allgemeines Protokoll zur Induktion Pluripotenz in embryonalen Fibroblasten der Maus oder MEFs, durch eine virale Transduktion.

Beachten Sie bevor Sie diese Schritte ausführen, dass Viren die Zellen in Ihrem Körper, infizieren können so folgende Sicherheitshinweise extrem wichtig.

Um die Transfektion zu beginnen, das Kulturmedium wird aus einer Platte mit einer hohen Dichte an MEFs entfernt, und die Zellen werden mit Pufferlösung gewaschen. Als nächstes wird eine Lösung mit einem Protein-abbauenden Enzyms, wie Trypsin, hinzugefügt, die Zellen von der Unterseite der Schale heben. Kulturmedium wird dann auf die Platte hinzugefügt, und die freistehenden Zellen werden in ein Zentrifugenröhrchen übertragen.

Das Pellet ist nach Zentrifugation, erneut in das Kulturmedium schweben. Als nächstes die Zellen werden gezählt und die Konzentration ist so eingestellt, dass eine optimale Anzahl von Zellen am nächsten Tag mit Virus infiziert werden kann. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.

Nachdem die Zellen auf ihr neues Gericht beigelegt haben, alte Medien werden ersetzt durch neue Medien und veränderte Viren mit den gewünschten Transkriptionsfaktoren werden hinzugefügt, um die Platte. Die Zellen werden dann mit den Viren für genügend Zeit, um die Infektion stattfinden zulassen inkubiert. Nach der Inkubation der kostenlosen Viren-haltigem Medium entfernt und ersetzt mit frischen embryonalen Stammzellen Medium.

Für 2-3 Wochen nach Umwandlung die Zellen sollte bei 37 ° c im Brutschrank angebaut werden, und die Nährmedien sollten täglich ausgetauscht werden.

Nach diesem Zeitraum sollte iPSC-Kolonien, die ähnlich wie embryonale Stammzellen Kolonien aussehen groß genug, um abgeholt werden. Die Kolonien können auf eine frische Platte mit Medium mit entsprechenden Wachstumsfaktoren übertragen, und erlaubt, weiter zu wachsen. Um Pluripotenz zu bestätigen, ist ein Teil der Zellpopulation mit Pluripotenz Markern gefärbt.

Nun, Sie gesehen haben, wie iPSCs aus differenzierten Zellen zu generieren, betrachten einige downstream-Anwendungen und Änderungen dieser höchst nützliche Methode.

Ein wichtiges Merkmal des iPSCs ist, dass sie verwendet werden können, um fast jede Zelle im Körper zu erzeugen. Dieses Beispiel zeigt Generation von Herzmuskelzellen, Herzzellen, aus iPSCs genannt. Um dies zu erreichen, sind die iPSCs auf nicht-anhaftende Platten übertragen, die ihnen erlauben, Embryoid Formkörper, die Aggregate von pluripotenten Stammzellen sind. Die Embryoid Körper sind in spezialisierten mittlere enthaltende Serum und Ascorbinsäure, die kardialen Differenzierung erhöht kultiviert. Erfolgreiche Differenzierung kann leicht beobachtet werden, wenn einige Zellen beginnen sich zu schlagen.

Da iPSCs potenziell in jeden Zelltyp differenzieren können, bilden sie auch einen gesamten Organismus, wie eine Maus. Dies kann mit einem Assay tetraploide Komplementierung genannt. Zunächst wird ein tetraploider Embryo, Embryo, enthält vier Sätze von Chromosomen, gebildet durch die Verschmelzung zweier Zellen des frühen Embryos zusammen mit einem elektrischen Feld. Tetraploide Embryo darf bis zum Blastozystenstadium entwickeln. iPSCs werden dann in die Blastozyste injiziert, die dann in einen Empfänger für Schwangerschaft weibliche verpflanzt wird. Die tetraploiden Zellen können nur extraembryonic Strukturen wie die Plazenta, also Tiere, die durch diese Methode völlig iPSCs abgeleitet werden.

Einige Forscher ändern die Neuprogrammierung Verfahren, um den Prozess der Identifizierung erfolgreich reprogrammierter Zellen effizienter zu machen. Zum Beispiel in diesem Experiment half MEFs mit der Fähigkeit, grünes fluoreszierendes Protein unter dem Einfluss des Veranstalters Oct4 express Forscher Zellen leicht zu identifizieren, die Pluripotenz erworben haben.

Sie haben nur Jupiters Video auf die Generierung von induzierten pluripotenten Stammzellen angesehen. Dieses Video überprüft die Prinzipien, die hinter diesem Verfahren und eine Schritt für Schritt Protokoll iPSCs aus differenzierten Zellen zu generieren. Wir überprüft auch, wie diese Methode angewendet oder für Experimente im Labor geändert werden könnte.

Die Entdeckung der iPSCs hatte einen enormen Einfluss auf dem Gebiet der Stammzellbiologie, denn es hat ein enormes Potenzial für die Entwicklung von Therapien, die zur Behandlung von degenerativer Erkrankungen eingesetzt werden können. Obwohl mit iPSCs viel Fortschritte erzielt hat, ist die Hürde, die noch überquert werden muss das damit verbundene Risiko von Krebs. Die Neuprogrammierung Verfahren haben das Potenzial, ungeregelte Zellwachstum führen, die zu Krebs führen kann. Daher ist mehr Forschung erforderlich, um tatsächlich iPSCs klinisch nutzen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

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