Die Transwell-Migration-Assay

Cell Biology
 

Summary

Migration von Zellen als Reaktion auf chemische Signale ist entscheidend für Entwicklung, Immunität und Krankheit Staaten wie zum Beispiel Krebs. Quantifizierung der Zellwanderung entwickelte eine einfachen Test 1961 durch Dr. Stephen Boyden, bekannt jetzt als die Transwell Migration Assay oder Boyden Kammer Assay. Diese Einrichtung besteht ein Insert trennt die Vertiefungen einer multiwell Platte in oberen und unteren Kammern. Zellen, deren Migration werden untersucht soll, sind in das obere Fach gesät und die Lockstoffgradient-Lösung befindet sich im Bodenfach. Nach der Inkubation kann zählen der Zellen in das Bodenfach Quantifizierung der Migration durch Chemoattractants induziert.

Dieses Video wird den gängigen Versuchsaufbau für Migrationsstudien Zelle überprüfen. Dann wir ein paar wichtige Überlegungen zu markieren, und eine generalisierte Protokoll für den Betrieb eines Experiments mit adhärenten Zellen zu skizzieren. Zu guter Letzt werden wir überprüfen verschiedene Anpassungen dieses Set-up aktuell verwendeten verschiedene Faktoren zu untersuchen, die Migration auswirken.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Cell Biology. Die Transwell-Migration-Assay. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Die Transwell-Migration-Assay ist eine klassische Technik, die Wissenschaftler, Zelle Bewegung zu quantifizieren können. Migration bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, einzeln oder in Büscheln zu bewegen. Zellbewegungen werden ermöglicht durch präzise Umstrukturierung ihrer Zytoskelett und Migration tritt in der Regel als Reaktion auf Reize, die als Hinweise dienen.

Heute besprechen wir die Transwell-Migration-Assay, die was nutzt eine einfache Kammer-Setup aus, um Migration als Reaktion auf Anziehung Hinweise zu beurteilen.

Wir werden zunächst einige Hintergrundinformationen über die Transwell Kammer.

Das Gerät wurde zuerst von Dr. Stephen Boyden 1961 entworfen, die es verwendet, um die Migration der Leukozyten zu studieren. Daher ist diese Methode auch bekannt als der Boyden Kammer Assay.

In einer einfachen Boyden Kammer ist die Außenwand der Brunnen, wie die von einer 96-Well-Platte. In jede Vertiefung ist eine Transwell, die einen zylindrischen Einsatz ist, platziert. Die Einlage hat eine Polycarbonat-Membran eines definierten Porengröße. Wenn in den Brunnen platziert, unterteilt die Kammer in zwei Fächer. Das obere Fach ist, wo dessen Wanderungsverhalten ist zu untersuchenden Zellen werden ausgesät, und der untere Stausee ist wo die Lösung des Lockstoffgradient platziert wird. Per Definition ist ein Lockstoffgradient ein Molekül, das die Fähigkeit hat, Zelle Motilität zu fördern, durch die "Gewinnung von Zellen."

Durch diese Anziehungskräfte wandern Zellen im oberen Fach durch die Poren in den unteren Behälter. Wenn die Zellen anhaftende Eigenschaften, wie einige Melanomzellen, nach Bewegung werden sie "an der Unterseite der Membran kleben". In diesem Fall kann die Membran befestigt werden, gebeizt, und Zellen unter dem Mikroskop gezählt werden können. Auf der anderen Seite werden in den unteren Behälter nicht anhaftende Zellen, wie Spermien, migrieren. In diesem Fall können Zellen in das Reservoir-Lösung mit Hilfe von einem Hemocytometer gezählt werden.

Obwohl das Setup für diese Test einfach ist, gibt es mehrere Dinge, die Sie vor dem Experiment beachten müssen. Betrachten wir einige von ihnen.

Beginnend mit der Aussaat Lösung, müssen Sie sicherstellen, dass die Dichte optimiert um Zellwanderung zu beobachten ist. Zu wenige Zellen nicht nachweisbar Migration führen können, und größere Dichte werden die Membran, erschwert das Auflisten von Migration übervölkern. Die zweite Überlegung ist die Porengröße des Einsatzes. Es sollte sorgfältig gewählt werden, je nach Zelltyp. Wenn die Porengröße zu klein ist, werden Zellen durchlaufen.

Alternativ, wenn die Poren zu groß ist, werden Zellen nur durch, fallen die ist keine Migration. Zu guter Letzt muss achten, die Lockstoffgradient-Konzentration und die Inkubationszeit für Migration erlaubt sein wie diese voneinander abhängig sind. Optimale Konzentration mit geeigneten Inkubationszeit bei dem Konzentrationsgefälle zwischen den Abteilen beibehalten wird induziert Zellwanderung durch die Chemo-Attraktion. Umgekehrt können längere Inkubationen begleitet werden, durch ein Gleichgewicht der Lockstoffgradient in der Kammer, die zum Verlust des chemischen Gradienten, die die Analyse der erzielten Ergebnisse verwirren kann.

Mit diesen Überlegungen im Auge sprechen wir über ein Protokoll zur Messung der Migration von adhärenten Zellen.

Zellen untersucht werden sind in einem Protease-freies Medium bereit, da Proteasen können wichtige Membranrezeptoren denaturieren und letztlich Migration beeinflussen. Nachdem Zellen vorbereitet sind, sollten die Aussetzung zu einer optimalen Aussaatdichte verdünnt werden. Um die Kammer vorzubereiten, werden Transwells in Brunnen auf einem multiwell Teller gelegt. Zellsuspension sollte in die Transwell pipettiert werden, ohne die Membran zu berühren oder die Einführung von Luftblasen.

Lockstoffgradient Lösung ist in den unteren Behälter dafür, dass die Lösung die Membran des Einsatzes berührt pipettiert. Die Inkubationszeit für die Migration wird von den experimentellen Erwägungen abhängen. Nach Inkubation werden die Membranen durch Eintauchen des Einsatzes in 70 % igem Ethanol fixiert. Nach Abzug des Einsatzes zu trocknen, wird die Zelle Färbelösung hinzugefügt.

Als nächstes werden Zellen für ca. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Inkubation werden die Einsätze mit Hilfe von Waschpuffer gewaschen. Schließlich kann die Membran ausgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt. Zellen auf der Unterseite der Membran stehen für die Anzahl der Zellen, die in der Gegenwart migriert haben und fehlender Chemoattractants.

Denn jetzt Sie ein Gefühl für das Protokoll haben, werfen wir einen kurzen Blick auf wie Forscher diese Methode in ihre Entdeckungen verwenden.

Die häufigsten Anwendungen des Assays gehört zu Lockstoffgradient Eigenschaften von unbekannten Substanzen zu bewerten. Hier interessierte Wissenschaftler untersuchen schwimmen wegen der Frosch Spermien in Anwesenheit von allurin, eine Substanz abgesondert von Amphibien Eiern. Um dies zu tun, pipettieren sie zuerst aktiv Frosch Spermien an die Spitze der Transwell Einsätze. Am Ende hinzugefügt sie allurin. Nach Abzug der Zellen migrieren, zählte sie Sperma in das Reservoir-Lösung unter dem Mikroskop. Mit dieser Technik konnten sie eine Konzentration-Wirkungs-Kurve zeigt die Wirkung der allurin Konzentration auf Sperma Migration zu erzeugen.

Wenn eine Zelle durch Krankheitserreger angegriffen wird, sendet er Chemoattractants Immunzellen zu rekrutieren, die migrieren, befestigen und anschließend beheben Infektion. Um dieses Phänomen zu testen, diese Wissenschaftler kultivierten Epithelzellen auf der Unterseite der Einsätze. Anschließend infiziert sie diese Zellen mit verschiedenen Bakterienstämme. Schließlich führte sie Immunzellen in die obere Kammer. Es ist bekannt, dass die infizierten Zellen mehrere Chemoattractants zu produzieren, die Migration von Immunzellen zu induzieren. Ergebnisse dieses Experiments zeigten unterschiedliche Grade der Neutrophilen Migration als Reaktion auf verschiedene Arten der bakteriellen Infektion.

Zu guter Letzt Krebs Zelle Invasion und Metastasierung durch die extrazelluläre Matrix hat schon immer fasziniert Zellbiologen. Hier wollte Wissenschaftler feststellen, wie bestimmte Chemoattractants können dazu beitragen, eine solche Migration durch eine 3D Matrix. Sie gentechnisch zwei separate Pools von Zellen: eine grüne fluoreszierende, zum Ausdruck zu bringen und ein anderes rot fluoreszierende, Protein. Sie pipettiert dann eine extrazelluläre Matrix-Mimic an die Spitze der Transwells.

Sobald erstarrt, sie invertiert die Transwell und zwei Pools der Zellen an der Unterseite der Membran ausgesät. Als nächstes sie ersetzt die Einlage in die multiwell Platte und die Lockstoffgradient-Lösung in die obere Kammer pipettiert. Dies verursacht die Zellen an der Unterseite und durch die 3D Matrix bewegen. Mit Hilfe der konfokalen Bildgebung diese Forscher Zellwanderung in 3D rekonstruiert, und die Migrationsmuster von zwei Gruppen von Zellen zu unterscheiden.

Sie haben genau beobachtete sich Jupiter Transwell Migration Test video an. Mit dem Verständnis der Komponenten und das Protokoll dieser Methode wissen Sie jetzt, warum es so weit von Zellbiologen verwendet wird. Trotz der Einfachheit dieser Einrichtung macht die Auswahl an Konfigurationen, die diese Methode anpassen kann es unverzichtbar für Zelle Motilität Studien. Wie immer vielen Dank für das ansehen!

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