行列の 3 D による浸潤能の測定

Cell Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Advanced Biology collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

細胞外マトリックス (ECM) は細胞や組織の構造のフレームワークを提供する分子のネットワークと細胞間コミュニケーションを容易にすることができます。三次元細胞培養の技術は、この細胞の in vitro研究環境をより正確にモデルにした.3 D 行列の移行時に多くの細胞プロセスは始め、剛の 2D サーフェス全体の動きに必要なものに似ていますこの高分子メッシュの ECM に侵入する細胞も ECM を使用して移行が必要です。

このビデオでは、構造と ECM の機能と細胞がそれを移行する方法の基本的なメカニズムを紹介します。次に、内皮細胞、3 D 行列に基づく他の実験に一般化できますの手順によって管形成のための試金のプロトコルを検討します。我々 は、ECM 浸潤アッセイを使用して対処することができます他のいくつかの生物学的質問を探索することで完了します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 細胞生物学の必需品. 行列の 3 D による浸潤能の測定. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

科学者はより正確に研究細胞浸潤および移行プロセスに 3D モデルを開発しました。最も伝統的な細胞培養システムは 2 D、当社組織内の細胞が細胞外マトリックス ECM と呼ばれる分子の 3 D ネットワーク内で存在します。2 D と 3 D の細胞の運動性に必要な機械的プロセスの多くは似ていますに、二次元の移行と比較してセルに異なる課題を提示すべてプラスチック表面、移行の 3 番目の次元の追加、ECM、長いポリマーのメッシュを移動の物理的な障害と比較して ECM の低剛性などの要因。

このビデオは、基本機能と細胞が変調し、それを移行のメカニズムと同様に、ECM の構造について簡単に紹介します。次に、内皮細胞浸潤を研究に使用される一般的なプロトコルを説明します。最後に、我々 はさまざまな生物学的質問を勉強する 3 D マトリックスのいくつかのアプリケーションを強調表示されます。

ECM、およびセルがそれと対話する方法の組成を調べることから始めましょう。

ECM は、細胞をサポートする、細胞間のコミュニケーションを促進する、組織を分離するなど、多くの機能を実行します。ECM 組成の異なる組織間で異なります、別の生物学的特性は、しかし、2 つの広範な種類に分類することができます。基底膜を固定し、別の組織、間質マトリックスを囲むティッシュ内の細胞をサポートし、提供しています。間質性のマトリックスは主に線維性のタンパク質コラーゲンの構成がまたエラスチン、フィブロネクチンが含まれています。

いくつかの生物学的プロセスは、ECM を通って移行するセルに対しては発生する必要があります。最初は、インテグリンと呼ばれる膜貫通タンパク質を含む細胞-マトリックス接着です。これらは細胞骨格として知られている細胞の内部足場に ECM をリンクします。

別のプロセスは、細胞の細胞骨格の構造的再編です。これは、その周囲のマトリックスに細胞の突起であるのと呼ばれる特殊な構造の形成に します。最後のステップは、ECM の変調です。これは通常マトリックス分解酵素または invadopodia に蓄積し、細胞浸潤を促進する周囲の ECM が低下する MMPs と呼ばれる分解の分子を含みます。3 D マトリックス浸潤アッセイは、視覚化し、この複雑なプロセスを研究する科学者を許可します。

今では ECM と細胞との相互作用に慣れている、フォームの細管に内皮細胞によって ECM 侵略を勉強するためのプロトコルを見てみましょう。3 D 環境で内皮細胞を培養によって、1 つは血管の成長とも呼ばれる血管新生、癌と同様、両方の正常な開発の間に重要である生物学的プロセスをシミュレートできます。

最初に、内皮細胞を培養しているし、単一細胞懸濁液は細胞塊を破るにプロテアーゼ トリプシンなどとセルを扱うとメッシュ フィルターを介してそれらを渡すことによって準備されます。3 D マトリックスはコラーゲン、フィブリン、ラミニン、またはこれらのコンポーネントのより複雑な組み合わせの一般的構成 — をラボでの準備または商用ベンダーから注文することができます-氷の上は解凍し。以来、ほとんどの ECM の準備は高温重合、冷たい保つために他の機器や試薬も便利です。細胞懸濁液は細胞を埋め込む解凍マトリックス ソリューションと混合されると、この混合物はより高い温度が重合する行列となります携帯文化のインキュベーターに配置されます。

セルを含む行列を設定すると、行列皿に血管新生因子を含む培地が追加されます。微速度顕微鏡観察のソフトウェアを使用して、個々 のセル、追跡できるマトリックスからの移行を観察します。結果の画像を分析し、セルの位置が移動方向とミクロン単位で距離を計算するため使用されます。歩行活動を決定するため、これらの値をプロットし、できます — セルの平均移行率。最後に、管ネットワークの形成は、観察し、分析可視化ソフトウェアを使用して、ノード、チューブ、ループなどの機能を識別します。

今、特定の実験の 3 D マトリックスのいくつかのアプリケーションを見てみましょう。

細胞は、細胞骨格のアクティブな変調により媒介されます。この実験でコラーゲン マトリックスは準備され可視化できるように赤の蛍光蛋白質を含んでいる汚れと混合します。浮遊細胞塊を個々 のセルの回転楕円体は分離され、コラーゲン マトリックスに埋め込まれました。次のインキュベーション、埋め込まれた細胞骨格の特定のコンポーネントのステンド グラス, 蛍光顕微鏡によるイメージング.研究者 ECM を介して移行細胞骨格成分とその変化が観察されました。

科学者たちは、ECM のプロパティが移行に影響を与えるを勉強できます。細胞がさまざまな濃度の外側の行列に囲まれた内部ゲルのマトリックスに埋め込まれている同心円状のジェル システムを使用して、科学者は、最初携帯無料外側のジェルに内側のゲルからの移行を検討する微速度顕微鏡観察を用いた細胞を追跡できます。研究者より高い濃度のゲルの高い剛性がセル変位および細胞遊走の全体的な距離の増加の結果を観察しました。

最後に、マトリックス浸潤アッセイは、器官に固有のコンテキストにおける血管新生の研究に生きている動物内で実行できます。ここでは、フィブリンのゲル-ティッシュ エンジニア リング、生分解性の性質のために一般的に使用される-生成、ゲルが蛋白質フィブリノゲンの「接着剤」の場所で開催されたマウスの肺に注入が続いていた。細胞の移動と新しい血管の形成は、固定、および断面その後肺やフィブリンが収穫された、次の 7 〜 30 日の発生を許されました。これらのセクションのイメージングでは、血管と肺胞における注入ゲル、その生体内での設定で研究者肺開発のこの重大な面に洞察力を与えることを明らかにしました。

細胞外マトリックス浸潤アッセイにゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、ECM と 3 D マトリックスを介して血管内皮細胞遊走の研究に単純なプロトコルを提示、それを細胞の移行方法を説明し、セル ECM 相互作用のコンテキストで現在研究されている複数の細胞プロセスを強調表示。内因性細胞の移動が 3 D 空間で発生するため、これらの生物学的条件ベスト 3次元培養技術によって表されます。マトリックス組成の改善より正確に再現し、細胞運動研究室での研究の科学者を許可し続けます。いつも見てくれてありがとう!

A subscription to JoVE is required to view this article.
You will only be able to see the first 20 seconds.

RECOMMEND JoVE

Applications