活性酸素種を検出

Cell Biology

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Summary

活性酸素は、化学的に活性酸素由来の分子が他の分子を酸化します。反応性の性質のため、未チェックの活性酸素産生、DNA と他の生体分子構造上の損傷を含むに関連付けられている多くの有害な影響があります。ただし、ROS も生理学的なシグナリングのメディエーターであることができます。ROS が外国人の病原体を殺す炎症性毒性の調停に転写因子の活性化に至るまでの重要な役割を果たすし、体を守るため蓄積された証拠があります。

このビデオで ROS、代謝と疾患の関係が掘り下げされます。 その意義を確立すると、原則、細胞内 ROS レベルを測定するための一般的に使用される方法論のプロトコルを説明します: 非蛍光性の使用プローブ酸化時に蛍光になります。最後に、細胞生物学の研究でこの技術のいくつかの現在のアプリケーションを検討します。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 細胞生物学の必需品. 活性酸素種を検出. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

細胞で生産される活性酸素は、組織の恒常性、細胞の老化や癌のような病気の状態に関与しています。名前からわかるとおり、これらの分子はすべてその電子がペアになっているので当然のことながら、安定した酸素分子として存在する酸素から生じる。不対電子は不安定をレンダリングし、スーパーオキシド陰イオンの形成につながる、1-活性酸素種または ROS のフォーム。スーパーオキシド陰イオン以外のセルは、厳密に制御することを目的とレベルによって不対電子と反応種のいくつかの種類があります。

このビデオでは、どのように活性酸素種は細胞の代謝と疾患、蛍光プローブと我々 はこの試金のための一般的なプロトコルの上行くよその検出を使用してアッセイの背後にある原理を探求する関連を学びます。最後に、我々 はどのように科学者は、このメソッドの実装実験で今日を調査いたします。

まず、どのように活性酸素種生成され、細胞の代謝と疾患での影響力を考慮を説明しましょう。

細胞の活性酸素種の重要な源はミトコンドリアです。通常は、セルの中に代謝電子は水への分子酸素の減少および ATP の同時生成で最高潮に達する、タンパク質複合体のチェーンを通じて転送されます。このプロセスの臨時規制にもかかわらず電子は漏洩し、スーパーオキシド陰イオンの形成。

スーパーオキシド陰イオンの存在は、ヒドロキシルラジカル、過酸化水素などの活性酸素種の他の形態にすぐに上昇を与えます。反応性の高い不対電子を持っている、すべてがこれらのラジカルは、膜、DNA およびタンパク質酸化損傷することが。対抗するため、セルは、スーパーオキシドジスムターゼのような酵素やフリーラジカルを低減するビタミン C のような分子の抗酸化剤備蓄を維持します。この防衛システムの不均衡は、過剰な活性酸素酸化ストレスとして知られている状態で、その結果、潜在的に致命的な正帰還ループで起因できます。

活性酸素は癌の開始そして進行に関与しています。これらの分子の別の有害な影響は、細胞の老化、またとして知られている老化の誘導です。遊離基理論の老朽化」は、正常な代謝中に細胞で生産される活性酸素種が細胞の老化と死を呼び起こすことを提案します。

今まで、我々 はこれらの非常に反応分子の負の側面を説明したが、細胞生理学同様に肯定的な役割があります。免疫応答中に食細胞病原体を巻き込むと、「呼吸バースト」が細胞の酸化的病原体を低下させる活性酸素を過剰が生成される時にマウントします。さらに、彼らは必要な中間体は、様々 な細胞シグナル伝達経路、レギュレータとも信号癌になっている細胞の死をすることができます。

これらの影響力のある細胞のオキシダントを定量化するには、科学者は、酸化する蛍光分子を利用します。活性酸素を検出するための一般的に使用されるプローブは、H2DCFDA またはジクロロ-ジヒドロ-フルオレセイン ・ ジアセテート、フルオレセインの非蛍光アナログです。セルに追加する場合、セル側の透過物本来は、受動的に拡散することができます。

その後、細胞内のエステラーゼは酢酸グループの割断における結果は、加水分解反応を触媒します。これには、セル内で保持されているので、化合物のより極。活性酸素種の広い範囲での水素原子の取り外しを含み、酸化非蛍光性 H2DCFDA は、高い蛍光ジクロロ-フルオレセイン、または DCF に変換されます。これは、読み取りおよびプレート リーダー、フローサイト、または蛍光顕微鏡によって定量化できます。

あなたは、この試金のしくみを知って、それを実験室の設定で実行する方法を見てみましょう。

細胞培養液中のリン酸緩衝生理食塩水を移すことによって開始それらを洗浄する遠心分離によって続いた。培養上清を削除し、蛍光プローブ H2DCFDA ソリューションを追加します。退色を防ぐために暗闇の中で色素ロード セルを孵化させなさい。インキュベーション後、プレートにアンロードされた染料と転送セルを削除するセルを洗浄してください。この時点で、実験的酸化ストレス誘導剤を追加できます。

分析の準備ができて、細胞がプレート リーダーに挿入できます。励起と発光の波長は、フルオレセインに対して設定されます。プレートが読み取られた後は、値を分析できます。結果は、特定の時点でのサンプル間の活性酸素種の相対的な量を明らかにします。

今では我々 は、実際のプロトコルを検討した、レッツ見てどのように適用される実験で今日。

研究者は、貪食機構を調査するため、この方法をよく使用します。科学者のこのグループ開発のさまざまな段階で免疫応答をマウントするゼブラフィッシュの機能を勉強したいです。前述のとおり、高活性酸素種、または「呼吸バースト」の世代で貪食結果、病原体を殺すために使用されます。酵素 NADPH オキシダーゼは貪食細胞に ROS の重要な生産、これらの科学者は NADPH 誘導ゼブラフィッシュを扱うことによってバースト応答を誘発しました。結果は、「バースト」応答は誘発したゼブラフィッシュ胚、の中で 72 時間後受精では、48 時間でそれらよりも高い活性酸素種開発後受精に示したことを示した。

向上の活性酸素種によるミトコンドリアの機能障害は、多くの病気の病理学的機能です。したがって、研究者は、酸化ストレスのレベルを測定することによってミトコンドリア機能障害を識別できます。ここで、科学者はニューロンに H2DCFDA をロードし、その後、蛍光顕微鏡にサンプルをマウントします。過酸化水素と同様の酸化ストレスの細胞体は、ミトコンドリア機能障害の徴候であることができる蛍光性の突然の増加を表示されます。

アストロ サイトは、酸化ストレスから中枢神経系のニューロンを保護するために提案されています。この重要性のためこれらの研究者はアストロ サイト外部誘導因子の存在下での酸化ストレスを検出するアッセイを開発することを目的しました。彼らは過酸化水素と活性酸素種検出蛍光プローブとアストロ サイトの孵化によってこれをしました。以降に発する蛍光は、流れの cytometer を用いていた。酸化ストレスに対する活性化アストロ サイトは右にシフトを見て増加した蛍光強度の地域に該当する観察されました。

活性酸素や活性酸素の検出にゼウスのビデオを見てきただけ。要約すると、このビデオでは、活性酸素、細胞の代謝や病気の間のリンクについて説明しました。原理と活性酸素種検出アッセイの手順を検討します。最後に、我々 は彼らの調査を研究者がどのようにこのメソッドに適用している検討。活性酸素種のまだ謎の役割の解析細胞生物学者の関心、蛍光プローブによる信頼性の高い測定は重要であることを証明します。いつも見てくれてありがとう!

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