Rekonstitution von Membranproteinen

Biochemistry

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Summary

Rekonstitution ist der Prozess der Rückkehr eines isolierten Biomolekül in seiner ursprünglichen Form oder Funktion. Dies ist besonders nützlich für die Untersuchung der Membranproteine, die ermöglichen wichtige Zellfunktionen und beeinflussen das Verhalten des nahe gelegenen Lipide. Um die Funktion des gereinigten Membranproteine an Ort und Stelle zu studieren, müssen sie wieder hergestellt durch eine künstliche Lipidmembran einzugliedern.

Dieses Video stellt Membrane Protein Rekonstitution Konzepte und Verfahren, wie Protein isoliert mit Reinigungsmittel, Bildung von künstliche Vesikel mit Lipiden, Einbeziehung des isolierten Proteins in die künstliche Vesikel und Trennung des Waschmittels aus der Lösung. Zu guter Letzt zwei Anwendungen abgedeckt werden: Wiederherstellung des Membran-Transportproteine und Rekonstitution des Licht-ernten Proteine.

Rekonstitution ist der Prozess der Wiederherstellung einer isolierten Biomolekül zu seiner ursprünglichen Form oder Funktionalität. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, wenn Membranproteine, die viele wichtige zelluläre Prozesse ermöglichen und beeinflussen das Verhalten des benachbarten Lipide zu studieren. Die Komplexität der Zelle Umgebung erschwert jedoch Membran Proteinfunktionen zu studieren in-situ. Die Proteine können extrahiert und gereinigt, aber ihre eigentlichen Funktionen nicht ohne eine Membran ausgewertet werden. Deshalb sind isolierte Membranproteine durch Integration in eine künstliche Lipidmembran, z. B. ein Liposom rekonstituiert . Dieses Video führt die Grundsätze der Membrane Protein Rekonstitution, eine allgemeine Rekonstitution und einige Anwendungen in der Biochemie.

Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden und Membranproteine. Die Phospholipide bilden eine Bilayer, in dem die hydrophilen Phosphat-Köpfe mit wässrigen innen und außen der Zelle, interagieren, während die hydrophoben Fettsäure-Tails in der Bilayer miteinander interagieren.

Manche Membranproteine interagieren nur mit der Membran durch elektrostatische oder Nichtkovalente Wechselwirkungen. Andere, genannt "integrale Proteine", sind in der Lipid-Bilayer eingebettet.

Wie der Bilayer integrale Proteine haben hydrophilen enden und eine hydrophobe Zentrum und durch hydrophobe Wechselwirkungen in Position gehalten werden. Integrale Proteine, die die gesamte Membran erstrecken sind bekannt als "transmembranen Proteine".

Die Wechselwirkungen zwischen dieser Proteine und die Membran sind so stark, dass sogar lyse der Zellen nicht trennen wird. Ein spezieller Tensid genannt ein Waschmittel wird verwendet, um die Proteine zu extrahieren. Ähnlich wie Phospholipide, Reinigungsmittel haben hydrophilen Köpfe und lipophilen Endstücke und können die Membran frei eingeben.

Innerhalb der Membran interagieren die lipophilen Endstücke des Waschmittels mit den hydrophoben Protein-Kern. Dies umschließt das Protein mit einer Schale der hydrophilen Waschmittel Köpfe, die die Protein-Lipid-Wechselwirkungen stört.

Der Protein-Reinigungsmittel-Komplex ist jetzt leicht von der Membran getrennt. Das Waschmittel macht den Komplex löslich in wässrigen Lösungen und bereit für die Wiederherstellung in eine künstliche Membran.

Proteine werden häufig in den Membranen der Liposomen, die künstliche Vesikel sind wiederhergestellt. Um Liposomen vorzubereiten, sind getrocknete Lipide hydratisiert und aufgeregt, um Vesikel Bildung zu induzieren. Wenn ein Spülmittel hinzugefügt wird, ist es die Membranen der Liposomen integriert.

Um das Protein wieder zusammenzusetzen, solubilisiert Proteine und Liposomen kombiniert, und dann das Waschmittel aus Lösung durch Dialyse oder chemische Adsorption entfernt. Die Proteine Liposomen schnell montieren und in Proteoliposomes, also nur die hydrophilen Gruppen ausgesetzt sind. Die Proteine funktionieren dann wie sie in einer Zellmembran und isoliert untersucht werden können.

Jetzt, wo wir die Grundlagen des Proteins Rekonstitution behandelt haben, gehen Sie wir über ein Protokoll für Neuaufbau Membranproteine in Liposomen.

Um zu beginnen, die Membranproteine zu isolieren, sind die Zellen lysiert. Ungebrochene Zellen werden mit Zentrifugation entfernt.

Der Überstand wird mit einer höheren Geschwindigkeit zu die Membranen Pellets zentrifugiert. Die Kugel ist wieder ausgesetzt und eine Reinigungsmittel wird hinzugefügt, um die Proteine zu extrahieren.

Die restlichen Zellenrückstand wird durch zusätzliche Zentrifugation entfernt. Das Protein ist von der Überstand mit Säulenchromatographie gereinigt und dann konzentriert oder weiter nach Bedarf gereinigt.

Um mit den Vorbereitungen der Liposomen, ist eine Suspension von Phospholipiden in organischen Lösungsmittel unter Stickstoff oder Argon getrocknet.

Die Phospholipide sind hydratisiert mit Hydratation Puffer, und die Mischung ist beschallt, um die Erstellung der Liposomen abzuschließen.

Waschmittel wird hinzugefügt, die Liposomen solubilisieren die ist dann mit den Proteinen kombiniert.

Das Reinigungsmittel wird durch Adsorption auf Polystyrol-Kügelchen, Dialyse oder eine Waschmittel-Bindung Spalte entfernt. Die sich daraus ergebenden Proteoliposomes sind bereit, gereinigt und in späteren Experimenten verwendet werden.

Nun, da Sie mit den Grundlagen von einer Membran-Protein-Rekonstitution vertraut sind, schauen Sie sich bitte an ein paar Anwendungen von Protein Rekonstitution in Biochemie.

Membrane Transportprotein war wieder hergestellt, um ein klareres Verständnis für seine Transportmechanismus zu gewinnen. Ihrer Funktion nach Rekonstitution wurde mit einem Ausfluss von Iodid-Ionen verifiziert. Dann wurde die Transportaktivität in Anwesenheit von verschiedenen niedermolekulare Ionen-Kanal-Hemmer und Potentiatoren untersucht. Auf diese Weise konnte der direkten Interaktionen dieser kleinen Moleküle mit dem Transportprotein untersucht werden.

Chlorophyll und Carotinoid-bindende Membranproteine in Pflanzen ernten Licht, Förderung der Ladungstrennung und leichte Schäden zu mildern. Durch diese Licht-ernten Proteine Neuaufbau, können ihre Faltung Dynamik und Interaktion mit Pigmenten studiert werden. Die Licht-ernten Proteine rekonstituiert mit dieser Technik hatte sehr ähnliche optische Eigenschaften, die native Proteine. Fluoreszenz-Emission-Spektroskopie kann dann zur Energieübertragung von Pigmenten in die rekonstituierte Licht-ernten Proteine zu studieren.

Sie haben nur Jupiters Video auf Wiederherstellung von Membranproteinen angesehen. Rekonstitution ist eine Möglichkeit, wichtige Proteine in einer Zelle Mimik zur weiteren Untersuchung übertragen. Dieses Video behandelt die Grundsätze der Protein Rekonstitution, eine Rekonstitution Protokoll und ein paar Anwendungen in der Biochemie. Danke fürs Zuschauen!

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Grundlagen der Biochemie. Rekonstitution von Membranproteinen. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

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