Co-Immunopräzipitation und Pull-Down-Assays
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Overview
Co-Immunopräzipitation (CoIP) und Pulldown-Assays sind eng verwandte Methoden, stabiles Protein-Protein-Wechselwirkungen zu identifizieren. Diese Methoden beziehen sich auf Immunopräzipitation, eine Methode für die Trennung ein Zielprotein an einen Antikörper aus ungebundenen Proteine gebunden. Im CoIP, ist ein Antikörper gebundene Proteine selbst verpflichtet, ein anderes Protein, das nicht mit dem Antikörper bindet, danach erfolgt ein Trennverfahren, das bewahrt die Proteinprotein komplexe. Der Unterschied in der Pulldown-Assays ist, dass die Affinität-Tags Köder Proteine ersetzen Antikörper und Affinitätschromatographie wird verwendet, um Protein-Protein-komplexe zu isolieren.
Dieses Video erklärt CoIP, Pulldown-Assays und deren Umsetzung im Labor. Ein Schritt für Schritt Protokoll für jede Technik wird abgedeckt, einschließlich der Reagenzien, Apparate und Instrumente verwendet, um zu reinigen und gebundene Proteine zu analysieren. Abschnitt “Programme” dieses Video beschreibt darüber hinaus ein Verfahren zur Untersuchung, wie Myxovirus Proteine hemmen Influenza Nucleoprotein, eine Untersuchung über die Rolle von Calcium-Ionen in Calmodulin über ein Pulldown-Assay und eine modifizierte Pulldown-Assay für Charakterisierung von transienten Protein-Interaktionen.
Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Funktionen. Die Mehrheit der Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihre biologischen Wirkungen muss noch identifiziert werden. Co-Immunopräzipitation oder CoIP und Pulldown-Assays sind zwei eng verwandte Methoden zur Identifizierung von stabilen Proteinprotein Interaktionen. Dieses Video wird die Grundsätze der beiden Assays, ihrer allgemeinen Laborverfahren und Anwendungen dieser Techniken abdecken.
CoIP und Pulldown-Assays sind Varianten des Immunopräzipitation, eine Methode zur Isolierung von selektiv ein Protein-Arten aus einer komplexen Lösung. In einem Experiment Immunopräzipitation darf ein Antikörper, der spezifisch für ein Zielprotein einen immun Komplex mit diesem Ziel in der Stichprobe zu bilden. Der Komplex wird dann auf eine solide Unterstützung, in der Regel eine Schranke, eine Perle Sepharose Protein erfasst. Alle Proteine, die nicht erfasst werden durch Zentrifugation Schritte entfernt. Das Protein wird dann von der Antikörper und solide Unterstützung durch Kochen bei der Verringerung der SDS-PAGE Probenbeladung Puffer freigegeben.
Co-Immunopräzipitation erfolgt auf die gleiche Weise, außer dass intakte Proteinkomplexe auf die solide Unterstützung erfasst werden. Der Antikörper bindet an das Zielprotein, die wiederum an ein anderes Protein gebunden ist, die nicht durch die Antikörper richtet. Wie Immunopräzipitation erscheint der Proteinkomplex aus Antikörper und solide Unterstützung durch Kochen bei der Verringerung der SDS-PAGE Probenpuffer laden.
Pulldown-Assays sind ähnlich wie co-Immunopräzipitation, unterscheiden sich nur in der Verwendung eines Proteins “Köder”, im Gegensatz zu einem Antikörper. Durch molekularbiologische Techniken ist dieser Köder-Protein mit einer Affinität-Tag, z. B. eine Reihe von Histidin Rückständen entwickelt. Diese Affinität-Tags sind im “Chromatographie-basierte Biomolekül Trennungen.” beschrieben. Das Protein wird dann auf einem immobilisierten Affinität Liganden spezifisch für den Tag erfasst. Das aufgenommene Protein wird dann mit einer Probe inkubiert mit Proteinen, die komplexe mit den “Köder” bilden. Der Protein-Komplex wird von der Affinität Unterstützung befreit, durch Waschen mit einer Lösung, die eine wettbewerbsfähige Analyt-spezifische für die Beschriftung auf dem “Köder” Protein. Pulldown-Assays sind nützlich für die Bestätigung von Protein-Interaktionen von co-Immunopräzipitation vorhergesagt und für die Entdeckung unbekannter Proteininteraktionen.
Nun, da die Prinzipien von co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays diskutiert worden sind, schauen Sie sich bitte an ihren Laborverfahren.
Ersten sprechen wir über co-Immunopräzipitation. Zu einer Reihe von Microfuge Rohren, wird Folgendes hinzugefügt: PBS-Puffer und eine 50 % ige Lösung von Protein A-Sepharose, ein Harz-Protein-Komplex, der an der Antikörper bindet. Die Microfuge Röhren sind gedreht, um die korrekte Verteilung zu gewährleisten, und dann wird das Harz mit zusätzlichen PBS-Puffer gewaschen. Zelle lysate, enthält das gewünschte Protein 2 μg Antikörper werden hinzugefügt, um die Microfuge Röhren und die Mischung wird für 1 h bei 4 ° c gedreht Die Perlen sind pelleted durch Zentrifugieren, Überstand wird verworfen, und die Perlen gewaschen wieder dreimal mit Puffer, nicht gebundenen Proteins zu entfernen. Die Perlen den Antikörper-Protein-Komplex, die enthalten sind bei der Verringerung der SDS-PAGE Probenbeladung Puffer, zur Entfernung von der Anlage aus der Antikörper und für die Analyse von SDS-PAGE und Immunoblotting.
Jetzt werden wir das Verfahren für Pulldown-Assays diskutieren: “Köder” Protein wird in ein Plasmid mit dem entsprechenden Affinität Tag ausgedrückt. Nach dem Log-Phase Wachstum erreichen, sind die Zellen lysiert und dann zentrifugiert. Abgehängte Streptavidin-Sepharose-Perlen, die Biotin-Tags “Köder” Protein zu erfassen, sind in ein Microfuge Röhrchen pipettiert. Die Perlen sind dann zentrifugiert und der Überstand vorsichtig durch Absaugen entfernt. Die Perlen werden dann gewaschen, mit Puffer, zentrifugiert, und der Überstand entfernt.
Zellen, die das vermeintliche “Beute” Protein, das eine Affinität für das “Köder” Protein hat, werden durch Zentrifugation geerntet. Der Überstand ist dann das Microfuge Rohr, enthält das Harz hinzugefügt und bei 4 ° C für 3 h auf einem Schüttler inkubiert. Das Harz wird dann zentrifugiert, der Überstand entfernt, und das Harz gewaschen, um nicht gebundenen Proteins zu entfernen. Elution Buffer wird hinzugefügt, um das Harz und die Mischung wird bei Raumtemperatur für 30 min auf einem Schüttler inkubiert. Das Harz wird dann zentrifugiert und der Überstand mit der gewünschten Anlage durch Immunoblotting analysiert.
Nun, da wir die Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der nützlichen Anwendungen von co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays.
Co-Immunopräzipitation kann in besseres Verständnis der Enzyme Wirkmechanismus nützlich sein. Myxovirus- oder Mx-Widerstand-Proteine hemmen eine Vielzahl von Viren, einschließlich der Influenza-A, bei denen der Mechanismus schlecht verstanden wird. Co-Immunopräzipitation wurde verwendet, um die Interaktion zwischen Maus Mx1 Protein und Grippe Nucleoprotein zu studieren.
Pulldown-Assays haben sich bewährt bei der Untersuchung der Auswirkungen von sekundären Botenstoffen, die Proteine, die ein Signal von der zellulären Umgebung kommunizieren. Sie sind ein Bestandteil von einem Signalweg, wo mehrere Proteine als Reaktion auf ökologische Hinweise interagieren. Calcium-Ionen wirken als sekundäre Botenstoffe durch die Bindung an Calmodulin, die wiederum eine Vielzahl von Proteinen, bindet viele Arten von biologischen Reaktionen zu vermitteln. Ohne das Kalzium kann nicht das Protein an die Calmodulin binden.
Co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays sind üblich für die Analyse von stabilen oder stark Protein-Interaktionen, aber nicht vergänglich. Eine neuere Entwicklung in Pulldown-Assays, die HaloTag, wurde die Studie von transienten Proteininteraktionen vereinfacht; HaloTag ist ein genetisch codierte Protein Fusion-Tag, mit dem Protein des Interesses, chemisch reagieren mit einem festen Träger Tetrafluormethan verschmolzen. Auf Wunsch Funktionsanalyse ist das Protein komplex und abzüglich der Tag in seiner Gesamtheit dann isoliert werden konnte durch Inkubation mit Tabak Ätzen Virus-Protease.
Sie haben nur Jupiters Video auf co-Immunopräzipitation und Pulldown-Assays angesehen. Dieses Video beschrieben die Grundsätze der beiden Methoden, die allgemeine Laborverfahren und einige ihrer Anwendungen.
Danke fürs Zuschauen!
Procedure
Disclosures
Transcript
Protein-protein interactions play a significant role in a wide variety of biological functions. The majority of protein-protein interactions and their biological effects have yet to be identified. Co-immunoprecipitation, or CoIP, and pull-down assays are two closely related methods for the identification of stable protein-protein interactions. This video will cover the principles of the two assays, their general laboratory procedures, and applications of these techniques.
CoIP and pull-down assays are variants of immunoprecipitation, a method for selectively isolating a protein species from a complex solution. In an immunoprecipitation experiment, an antibody specific to a target protein is allowed to form an immune complex with that target in the sample. The complex is then captured on a solid support, typically protein A bound to a sepharose bead. Any proteins not captured are removed by centrifugation steps. The protein is then released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer.
Co-immunoprecipitation is conducted in the same manner, except that intact protein complexes are captured onto the solid support. The antibody binds to the target protein, which, in turn, is bound to another protein that is not targeted by the antibody. As in immunoprecipitation, the protein complex is released from the antibody and solid support by boiling in reducing SDS-PAGE sample loading buffer.
Pull-down assays are similar to co-immunoprecipitation, differing only in the use of a “bait” protein, as opposed to an antibody. Through molecular biology techniques, this bait protein is engineered with an affinity tag, such as a series of histidine residues. These affinity tags are described in “Chromatography-based Biomolecule Separations.” The protein is then captured on an immobilized affinity ligand specific for the tag. The captured protein is then incubated with a sample that contains proteins that form complexes with the “bait”. The protein complex is released from the affinity support by washing with a solution containing a competitive analyte specific for the tag on the “bait” protein. Pull-down assays are useful for confirming protein interactions predicted by co-immunoprecipitation, and for discovering unknown protein interactions.
Now that the principles of co-immunoprecipitation and pull-down assays have been discussed, let’s look at their laboratory procedures.
First let’s discuss co-immunoprecipitation. To a series of microfuge tubes, the following is added: PBS buffer, and a 50% solution of protein A-sepharose, a resin-protein complex that binds to the antibody. The microfuge tubes are rotated to ensure proper distribution, and then the resin is washed with additional PBS buffer. Cell lysate, containing the desired protein, and 2 μg of antibody are added to the microfuge tubes, and the mixture is rotated for 1 h at 4 °C. The beads are pelleted by centrifugation, the supernatant is discarded, and the beads re-washed three times with buffer to remove non-bound protein. The beads containing the antibody-protein complex are in reducing SDS-PAGE sample-loading buffer, for removal of the complex from the antibody and for analysis by SDS-PAGE and immunoblotting.
Now we will discuss the procedure for pull-down assays: The “bait” protein is expressed in a plasmid with the appropriate affinity tag. After reaching log-phase growth, the cells are lysed, and then centrifuged. Suspended streptavidin-sepharose beads, which capture biotin-tagged “bait” protein, are pipetted into a microfuge tube. The beads are then centrifuged and the supernatant carefully removed by aspiration. The beads are then washed with buffer, centrifuged, and the supernatant removed.
Cells containing the putative “prey” protein, which has an affinity for the “bait” protein, are harvested by centrifugation. The supernatant is then added to the microfuge tube containing the resin, and incubated at 4 °C for 3 h on a shaker. The resin is then centrifuged, the supernatant removed, and the resin washed to remove non-bound protein. Elution buffer is added to the resin, and the mixture is incubated at room temperature for 30 min on a shaker. The resin is then centrifuged, and the supernatant containing the desired complex is analyzed by immunoblotting.
Now that we’ve reviewed the procedures, let’s look at some of the useful applications of co-immunoprecipitation and pull-down assays.
Co-immunoprecipitation can be useful in better understanding of enzymes’ mechanism of action. Myxovirus-, or Mx-, resistance proteins inhibit a wide range of viruses, including influenza A, for which the mechanism is poorly understood. Co-immunoprecipitation was used to study the interaction between mouse Mx1 protein and influenza nucleoprotein.
Pull-down assays have proven useful in studying the effects of second messengers, which are proteins that communicate a signal from the cellular environment. They are a component of a signaling pathway where multiple proteins interact in response to environmental cues. Calcium ions act as secondary messengers by binding to calmodulin, which, in turn, binds to a wide variety of proteins, mediating many types of biological responses. Without the calcium, the protein can’t bind to the calmodulin. A pull-down assay was conducted to test the ability of proteins to bind to calmodulin in the presence or absence of calcium ions.
Co-immunoprecipitation and pull-down assays are generally used for analyzing stable or strong protein interactions, but not transient ones. A recent development in pull-down assays, the HaloTag, has simplified the study of transient protein interactions; HaloTag is a genetically-encoded protein fusion tag, fused to the protein of interest, capable of chemically reacting with a haloalkane solid support. If functional analysis is desired, the protein complex, minus the tag, in its entirety could then be isolated by incubating with tobacco etch virus protease.
You’ve just watched JoVE’s video on co-immunoprecipitation and pull-down assays. This video described the principles of the two methods, the general laboratory procedures, and some of their applications.
Thanks for watching!
