Histotypic cultivo de tejidos

Bioengineering

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Summary

Aunque cultura bidimensional del tejido ha sido común durante algún tiempo, las células se comportan más realista en una cultura tridimensional y más estrechamente imita tejido propio. Este video presenta histotypic cultivo de tejidos, donde el crecimiento y la propagación de una línea celular se realiza en una matriz tridimensional diseñada para llegar a alta densidad celular. A continuación, os mostramos la recolección de las células del tejido del donante, seguido por el cultivo celular en una construcción de ingeniería.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Bioingeniería. Histotypic cultivo de tejidos. JoVE, Cambridge, MA, (2018).

Histotypic cultivo de tejidos permite a las células crecer en tres dimensiones, creando in vitro morfologías de tejido que mímico de cerca la función realista del tejido, que puede ser utilizada como constructos viables para la reparación de los tejidos. Estas culturas suelen ser tres estructuras dimensionales que consta de un solo tipo de células cultivado en alta densidad. Las tres dimensiones de la estructura, también conocidas como el andamio, imita a la matriz extracelular natural. Dependiendo del tipo de célula utilizado, andamios pueden ser diseñados para una aplicación específica y suele actúan como una plantilla para el tejido bio-mimético. Este video presenta los fundamentos de la histotypic culturas del tejido, un procedimiento para el aislamiento de las células, y la fabricación y cellularization de un tejido poroso de seda del andamio para imitar el tejido cardiaco.

Todos los tejidos consisten en dos componentes fundamentales, la matriz extracelular y las células de tejidos específicos que lo habitan. La matriz extracelular es una red de proteínas estructurales que crear un ambiente tridimensional de las células a ocupar, y las células dentro de él se pretenden recapitular los nativos procesos fisiológicos del tejido. En la actualidad, una técnica común utilizada al tejido modelo es dos dimensiones cultivo de tejidos, donde las células son dispensadas sobre un sustrato plano y permite formar una película delgada. En general, este método no es confiable para mantener un fenotipo en vivo, funciones específicas de órgano y célula a célula o célula a interacciones contextuales de sustrato. Cultivo de tejidos Histotypic alivia las limitaciones proporcionando un andamio 3D para que las células crecen, resultando en una densa red de células que más estrechamente imita morfologías celulares nativas y facilita el desarrollo de redes intercelulares realista y vías de comunicación. Una variedad de redes de polímero 3D, incluyendo alfombras de seda hidrogeles y electrospun, ofrecen formas convenientes a las células de tejidos específicos de la cultura en tres dimensiones. Para rellenar estos andamios, las células deben estar aisladas. Células primarias utilizadas en este video se obtienen del tejido vivo, que es picado y luego digerido en una solución de enzima para separar las células de la blanco de la matriz extracelular. Una vez que las células están aisladas, hay dos técnicas utilizadas para los andamios de la semilla. La técnica de gota implica uso una solución de células sobre el andamio a una velocidad lenta y constante. La segunda, o la técnica de suspensión celular, se sumerge el andamio en una suspensión. A menudo, el andamio y la suspensión se agitan para fomentar la migración de la célula en la matriz. Ambas técnicas resultan en construcciones bio-dirigido con las densidades de célula alta. Los siguientes procedimientos implica el aislamiento de las células cardiacas y la técnica de suspensión de célula para crear un andamio de específicos de la célula cardiaco, como conserva la morfología de tejido del corazón nativo.

Para iniciar el proceso de aislar las células del tejido del donante, empezar por asegurar que se esterilizan los instrumentos de disección y área de trabajo. Luego, coloque un paño estéril sobre la superficie de trabajo en el gabinete de seguridad biológica. Coloque los instrumentos quirúrgicos estériles sobre el cobertor sin tocarlas y abra una hoja de bisturí estéril número 20. Después euthanizing el espécimen, esterilizar el área quirúrgico con una gasa empapada en betadine. Cuando esté listo, fije la muestra y comenzar el procedimiento quirúrgico para aislar el tejido de interés. En este caso, será el corazón. Una vez suprimido, coloque el tejido en hielo en la placa Petri que contiene glucosa de PBS. Eliminar la sangre residual o del tejido conectivo y luego transferir el tejido a una placa Petri con glucosa de PBS fresca. Luego, utilizando micro estériles-tijeras y pinzas, picar cuidadosamente las muestras de tejido en trozos de aproximadamente 1 milímetro cúbico. Usando una pipeta, transferir las piezas y el buffer a un tubo cónico. Luego, saque todo pero 10 mililitros de buffer. Agregar 7 ml de solución de colagenasa y luego agite la mezcla a 37 º c durante 7 minutos. Entonces, pipetee suavemente 10 veces para romper las piezas de tejido. Deje que las piezas a colocar y luego aspirar el líquido y deséchela. A continuación, repita la digestión y pipetee suavemente la solución para romper las piezas de tejido. Después de habrán colocado las piezas, aspirar el sobrenadante y recoger en un tubo cónico separado 50 mililitros. Luego, añadir 10 ml de solución de parada a cada tubo cónico que contiene el sobrenadante para detener la digestión.

Ahora que se han aislado las células primarias, vamos a fabricar un andamio poroso tejido de seda. Para empezar, vierte 30 mililitros de la solución de seda en un molde. A continuación, dispersión 60 gramos de cloruro de sodio tamizado uniformemente sobre la solución. Luego, deje que la seda polimerizar imperturbado a temperatura ambiente durante 48 horas. Luego, coloque el molde en un horno de 60 grados durante 1 hora finalizar el cross-linking y evaporar el líquido sobrante. Una vez polimerizado, sumerja el molde en un vaso de agua destilada durante 48 horas a leech sal. Luego, retirar el andamio del molde y cortar pequeños discos con un milímetro 5 biopsia punch. Recortar los discos a una altura de 2 milímetros y por último, eliminar los centros de cada pieza con un punzón de biopsia de 2 milímetros para crear un anillo. Por último, autoclave los andamios en un ciclo húmedo durante 20 minutos.

Con el andamio preparado, vamos a empezar la célula del proceso de siembra. En primer lugar, colocar un andamio estéril por pozo en una placa bien 96. Luego, se añade medio de cultivo celular para sumergir los andamios e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos se equilibren durante al menos 30 minutos. Tras incubación, aspirar el exceso medio y luego agregar la suspensión aislada de células primarias a los andamios. A continuación, devolver la placa a la incubadora y dejar toda la noche para que las células a los andamios. A la mañana siguiente, cuidadosamente aspirar las células no adheridas y reemplazar con 200 microlitros de medio de cultivo fresco células por pozo. El andamio resultante es una construcción porosa con una alta densidad celular lista para ser utilizado.

Ahora que usted ha aprendido cómo realizar cultivo de tejidos histotypic, echemos un vistazo a algunas aplicaciones prácticas de estos materiales. Histotypic cultivo de tejidos puede crear microambientes celulares que imitan los tejidos nativos y como resultado son capaces de proporcionar un modelo adecuado para el estudio del comportamiento celular sobre un solo tipo de células. Por ejemplo, fibra 3D en andamios, que imitan con mayor precisión el nicho de células madre encontrado en vivo, puede ser sembrada con células pluripotentes para señales biológicas y determinar sus efectos sobre la diferenciación de células madre. Este trabajo, en definitiva, puede proporcionar una mayor comprensión de cómo las células madre diferenciar y pueden ofrecer ideas sobre mejorar la diferenciación celular y regeneración para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Como dinámica de las culturas, acondicionado mecánico también puede mejorar el andamio de tejido 3D sometiendo a varias cargas mecánicas que tejidos naturales pueden experimentar en vivo. Aplicando cargas biaxiales y compresión durante el crecimiento celular, la morfología de la célula y la matriz extracelular se altera para reflejar las cargas mecánicas. Esto resulta en un andamio de tejido genéticamente acondicionarse con una estructura celular parecida a tejido propio, lo que es ideal para la implantación en áreas que pueden experimentar fuerzas mecánicas similares. Por último, construcciones de la ingeniería del tejido pueden usarse para reemplazar o reparar defectos del tejido. Para lograr esto, el andamio de tejido debe ser primero vascularizado, permitiendo sangre para moverse libremente a través de la construcción. Una vez vascularizado, el andamio puede transferir e implantan en el defecto del tejido para iniciar la reparación. Injerto exitoso más adelante puede ser confirmado mediante histología, que revela o no el tejido construir completamente repara el área dañada.

Sólo ha visto introducción de Zeus para cultivo de tejidos histotypic. Ahora debe entender como simple 3D se preparan las estructuras, como células primarias son aisladas y sembradas sobre un andamio y las diferentes aplicaciones de estas culturas en el campo de la bio-ingeniería. Gracias por ver.

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