Licht / donker Overgang test voor Muizen

Summary

Het licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. Hier presenteren we een film die gedetailleerde procedures over hoe we het gedrag van de test toont.

Abstract

Hoewel alle van de muis genoomsequenties zijn vastgesteld, weten we nog niet weten de functies van de meeste van deze genen. Gen-targeting technieken, kan echter worden gebruikt voor het verwijderen of te manipuleren een specifiek gen in muizen. De invloed van een bepaald gen op een bepaald gedrag kan dan worden bepaald door het uitvoeren van gedrags-analyses van de mutante muizen. Als een test voor gedragsverandering fenotypering van mutante muizen, de licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. De test is gebaseerd op de natuurlijke afkeer van muizen om helder verlichte gebieden en op hun spontane verkennende gedrag in nieuwe omgevingen. De test is gevoelig voor anxiolytische medicamenteuze behandeling. Het apparaat bestaat uit een donkere kamer en een helder verlichte kamer. Muizen zijn vrij kunnen bewegen tussen de twee kamers. Het aantal vermeldingen in de lichte kamer en de duur van de tijd zijn er indices van helder-ruimte angst bij muizen. Voor het verkrijgen van fenotypering resultaten van een stam van mutante muizen die gemakkelijk kan worden gereproduceerd en vergeleken met die van andere mutanten, dient de gedrags-testmethoden worden zo identiek mogelijk tussen laboratoria. De procedurele verschillen die er tussen laboratoria, echter, maken het moeilijk om te repliceren of de resultaten vergelijken tussen laboratoria. Hier presenteren we onze protocol voor de licht / donker overgang test als een film, zodat de details van het protocol kan worden aangetoond. In ons laboratorium hebben we onderzocht meer dan 60 stammen van mutante muizen met behulp van het protocol in de film. Deze gegevens zullen worden verstrekt als onderdeel van een openbare databank die we nu bouwen.

Visualisatie van het protocol zal vergemakkelijken begrip van de details van de gehele experimentele procedure, waardoor standaardisatie van de protocollen gebruikt in laboratoria en vergelijkingen van de gedrags-fenotypen van verschillende stammen van mutante muizen beoordeeld met behulp van deze test.

Protocol

1. Het apparaat wordt gebruikt voor de licht / donker overgang test bestond uit een kooi (21x42x25 cm), verdeeld in twee delen van gelijke grootte van een partitie met de deur (Ohara & Co, Tokio).
2. Muizen zijn ondergebracht drie tot vier per kooi in een kamer met een 12 uur licht / donker-cyclus (verlichting op 7:00) met ad libitum toegang tot voedsel en water. In het ideale geval worden twee controles en twee mutanten bij elkaar gehuisvest, door het opnieuw organiseren van de muizen, zodra ze zijn gegenotypeerd op het moment van spenen. Behavioral test is uitgevoerd 09u00-18u00 Alle kooien met muizen worden overgebracht naar het gedrag testkamer 30 minuten voordat de eerste proef begint.
3. Een kamer is fel verlicht door witte diodes (390 lux), terwijl de andere kamer is donker (2 lux). Muizen zijn geplaatst in de donkere kant en de deur wordt geopend automatisch 3 seconden nadat de muis wordt gedetecteerd door de infrarood camera. De deur wordt zo gebruikt dat de muizen niet het licht kamer onmiddellijk na de release met hun motivatie om te ontsnappen aan experimentator, aangezien de latency naar het licht kamer betreden kan dienen als een index van angst-achtig gedrag.
4. Muizen zijn vrij kunnen bewegen tussen de twee kamers met een deur open gedurende 10 minuten. De applicatie wordt gebruikt voor het verkrijgen en analyseren van de gedrags-gegevens (Image LD4) is gebaseerd op het publieke domein Image J-programma (ontwikkeld byWayne Rasband aan het National Institute of Mental Health en verkrijgbaar bij http://rsb.info.nih.gov/ij /), die werd gewijzigd door Tsuyoshi Miyakawa (beschikbaar via O'Hara & Co, Tokyo, Japan).
5. De afgelegde afstand in elke kamer, het totale aantal overgangen, de tijd doorgebracht in de elke kamer, en de latency aan het licht chamberare opgenomen door Image LD4 programma te openen.
6. Na elke proef zijn alle kamers schoongemaakt met super hypochloor water tot een scheeftrekking op basis van olfactorische signalen te voorkomen.

Discussion

Hoewel alle van de muis genoomsequenties zijn vastgesteld, zijn de functies van de meeste van deze genen niet bekend. Gen-targeting technieken, kan echter worden gebruikt voor het verwijderen of te manipuleren een specifiek gen in muizen (Aiba et al., 2007;. Austin et al., 2004.). De invloed van een bepaald gen op een bepaald gedrag kan dan worden bepaald door het uitvoeren van gedrags-analyses van de mutante muizen (Takao en Miyakawa, 2006;. Takao et al., 2007). Als een test voor gedragsverandering fenotypering van mutante muizen, de licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen (Crawley, 2000). De test is gebaseerd op de natuurlijke afkeer van muizen om helder verlichte gebieden en op hun spontane verkennende gedrag in nieuwe omgevingen (Crawley, 1985). De test is gevoelig voor anxiolytische medicamenteuze behandeling (Crawley, 1985). Het apparaat bestaat uit een donkere kamer en een helder verlichte kamer. Een beperkte opening, 3 cm hoog bij 5 cm breed, verbindt de twee kamers. Muizen zijn vrij kunnen bewegen tussen de twee kamers. Het aantal vermeldingen in de lichte kamer en de duur van de tijd zijn er gebruikt als indices van helder-ruimte angst bij muizen.

Het licht / donker overgang test is oorspronkelijk ontwikkeld door Crawley en collega's (Crawley en Goodwin, 1980). Er zijn twee verschillen tussen de originele versie en onze test. Ten eerste het licht kamer is groter dan de donkere kamer in de originele versie, terwijl de grootte van de twee kamers hetzelfde is in onze versie van de test. Ten tweede, in de oorspronkelijke versie, het licht kamer had geen plafond en de muren van de kamer licht transparant waren (Crawley en Goodwin, 1980), terwijl we gebruik van ondoorzichtig wit plastic voor het plafond en de wanden van het licht kamer. Deze verschillen, namelijk de omvang en de toegankelijkheid van het licht kamer, zorgen voor de simultane detectie van heldere ruimte angst als open-ruimte angst in de oorspronkelijke versie van de test. In ons laboratorium, echter, open-space angst-achtig gedrag bij muizen is getest in een verhoogde plus doolhof. De ondoorzichtige muren en het plafond, de grootte van het licht kamer, en onze specifieke licht / donker overgang testprotocol is meer gespecialiseerd voor het detecteren van licht-space angst ten opzichte van de originele versie.

Hoewel de licht / donker overgang te testen en een verhoogde plus maze worden allebei gebruikt voor de beoordeling van angst-achtig gedrag, zijn de resultaten niet altijd even consistent. Bijvoorbeeld, voorhersenen-specifieke calcineurine knockout muizen besteden een verminderde hoeveelheid tijd in het licht kamer in het licht / donker overgang test, maar een verhoogde hoeveelheid van de tijd in de open armen in de verhoogde plus maze (Miyakawa et al.., 2003) . Onze hypothese was dat ons licht / donker overgang te testen en een verhoogde plus maze test verschillende aspecten van angst-achtig gedrag, zoals helder-ruimte angst en open-ruimte angst-achtig gedrag te beoordelen. Om deze hypothese te testen, hebben we gebruik gemaakt van een grote dataset verzameld met behulp van dezelfde muizen in beide tests. In ons laboratorium, voeren we gedragstest batterijen die vele domeinen om te screenen voor de gedragsmatige betekenis van genen. De test batterij moet een aantal weken in beslag. Tijdens de testperiode, muis kooien gehouden op een rek in onze faciliteit. Als muizen zijn vervoerd naar het laboratorium van andere instellingen, zijn ze gewend aan het milieu van onze faciliteit voor minimaal 1 week. Na de gewenningsperiode, zijn muizen onderworpen aan een algemene gezondheid te controleren en neurologische screening (Miyakawa et al.., 2003), en na deze eenvoudige onderzoeken, muizen zijn onderworpen aan de licht / donker overgang test. De test wordt uitgevoerd in een geluidsdichte kamer experimenteel na 30 minuten van gewenning aan de experimentele ruimte, zoals getoond in de film.

Wij hebben meer dan 60 stammen van genetisch gemanipuleerde mutante muizen met behulp van het protocol in de film en hebben een grote set van de ruwe gegevens voor meer dan 3.000 muizen (met inbegrip van wild-type en mutante muizen). Wij hebben factoranalyses om te profiteren van de grote set van de ruwe data. Inderdaad, we verschillende factoren gevonden van elke test (niet gepubliceerde gegevens), hoewel er enkele significante correlaties tussen de indices (ongepubliceerde gegevens) .. Deze gegevens zullen worden verstrekt als onderdeel van een openbare databank die we nu bouwen.

In onze test batterij, zijn wild-type nestgenoten meestal gebruikt als een controle. Als een achtergrond stam, zijn C57BL/6J muizen gebruikt. We verzamelden de gegevens van C57BL/6J muizen gebruikt als een controle van de mutant muizen in de testbatterij. De indices verkregen uit C57BL/6J muizen in onze licht / donker overgang testen waren als volgt (n = 795 met een gemiddelde SEM), de afgelegde afstand: 846,5 8,88 cm in het licht kamer, 1.478,5 9,53 cm in de donkere kamer; duur van de tijd besteed aan : 215,8 1,85 s in het licht, 395,8 1,86 s in het donker; aantal overgangen tussen de compartimenten: 30,52 0,43; latency naar het licht kamer in te voeren: 64,94 2,40 s. Beweging van muizen rond de ingangen van de kamers wordt gedetecteerd door de camera en wordt geteld als de tijd doorgebracht in zowel CHambers. Vanwege dit, de som van de gemiddelde duur van de tijd doorgebracht in het licht en dat in het donker compartimenten groter was dan die van de gehele duur van de test (600 s).

In ons protocol, is een muis voor het eerst geplaatst in de donkere kamer. Drie seconden na het plaatsen van de muis in de donkere kamer, de deur tussen de kamers wordt automatisch geopend en de muis kan vrij bewegen tussen de twee kamers. C57BL/6J muizen besteden minder tijd in het licht kamer dan in de donkere kamer (p <0,0001, de duur als de tijd doorgebracht in het licht: 215.8 1.85 s, de duur van de tijd doorgebracht in het donker: 316.3 2.11 s [de tijd doorgebracht in het donker doet niet de eerste tijd in het donker voorafgaand aan het invoeren van de licht kamer voor de eerste keer], n = 795, gepaarde t-test). Dit geeft aan dat C57BL/6J muizen hebben de neiging om het licht kamer te vermijden, en dat de tijd doorgebracht in het licht is een goede index van angst-achtig gedrag.

De resultaten van verschillende stammen van mutante muizen gemakkelijk worden vergeleken, omdat alle gegevens zijn verkregen met behulp van hetzelfde protocol. Voor het verkrijgen van fenotypering resultaten van een stam van mutante muizen die gemakkelijk kan worden gereproduceerd en vergeleken met gegevens van andere mutanten, dient de gedrags-testmethoden worden zo identiek mogelijk tussen laboratoria. Crabbe en zijn collega's testten de interactie tussen de muis gedrag en laboratorium-omgeving met behulp van exact dezelfde inteeltstammen en een null mutante stam. In hun studie, het apparaat, testprotocollen, en vele omgevingsvariabelen werden grondig gestandaardiseerd. Ondanks de standaardisatie, vonden zij systematische verschillen in gedrag tussen laboratoria, hoewel ze ook gedetecteerd stam verschillen in alle gedragingen (Crabbe et al.., 1999). Ze meldden dat oncontroleerbare variabelen en experimenten karakteriseren van mutanten kunnen de resultaten die zijn eigenzinnig om een ​​bepaald laboratorium opbrengst. De procedurele verschillen tussen laboratoria maken het moeilijk om te repliceren of de resultaten vergelijken tussen laboratoria. Hier presenteren we onze protocol voor de licht / donker overgang test als een film, zodat de details van het protocol kan worden aangetoond.

Tot vaststelling van visuele documentatie van het protocol zal vergemakkelijken beter begrip van de details van de experimentele procedures, waardoor standaardisatie van de protocollen gebruikt in laboratoria en voor vergelijkingen van de gedrags-fenotypen van verschillende stammen van mutante muizen beoordeeld met behulp van deze test. Films van andere protocollen, zoals voor de verhoogde plus maze, open veld te testen, porsolt geforceerde zwemtest, angst conditionering, die we gebruiken in onze gedrags-testbatterij worden momenteel gemaakt voor publicatie als toekomstig video tijdschriftartikelen.