Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Summary

Der Hell / Dunkel-Übergangs-Test ist eine der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen zu messen. Hier präsentieren wir einen Film, der detaillierte Verfahren, wie wir Verhalten der Test zeigt.

Abstract

Obwohl alle Maus-Genom-Sequenzen bestimmt wurden, wissen wir noch nicht wissen, die Funktionen der meisten dieser Gene. Gene-Targeting-Techniken kann jedoch verwendet werden, um zu löschen oder manipulieren ein bestimmtes Gen in Mäusen werden. Der Einfluss eines bestimmten Gens zu einem bestimmten Verhalten kann dann durch die Durchführung Verhaltensanalysen der mutierten Mäusen bestimmt werden. Als Test für die Verhaltens-Phänotypisierung von Mausmutanten, die Hell / Dunkel-Übergangs-Test einer der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen zu messen. Der Test basiert auf der natürlichen Abneigung der Mäuse zu hell beleuchteten Bereichen und auf ihre spontane Erkundungsverhalten in neue Umgebungen. Der Test ist empfindlich auf anxiolytische medikamentöse Behandlung. Der Apparat besteht aus einer dunklen Kammer und eine hell erleuchtete Kammer. Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen zwischen den beiden Kammern. Die Anzahl der Einträge in das helle Kammer und die Dauer der Zeit gibt es Indizes der Hell-Raum Angst bei Mäusen. Um Phänotypisierung Ergebnisse eines Stammes von mutierten Mäusen, die leicht reproduzierbar und vergleichbar mit denen anderer Mutanten, sollte die Verhaltens-Prüfverfahren werden so identisch wie möglich zwischen den Laboratorien. Die verfahrensrechtlichen Unterschiede zwischen den Labors gibt, machen es jedoch schwer zu replizieren oder vergleichen Sie die Ergebnisse von Labor zu Labor. Hier präsentieren wir unsere Protokoll für die Hell / Dunkel-Übergangs-Test als einen Film, so dass die Details des Protokolls nachgewiesen werden kann. In unserem Labor haben wir mehr als 60 Stämme von mutierten Mäusen unter Verwendung des Protokolls in dem Film gezeigt, beurteilt. Diese Daten werden als Teil einer öffentlichen Datenbank, die wir jetzt bauen werden offen gelegt werden.

Visualisierung des Protokolls erleichtern das Verständnis der Details des gesamten experimentellen Verfahren, ermöglicht eine Standardisierung der Protokolle über Labors und Vergleiche der Verhaltens-Phänotypen der verschiedenen Stämme von mutierten Mäusen beurteilten mit Hilfe dieses Tests.

Protocol

1. Die Geräte für die Hell / Dunkel-Übergangs-Test bestand aus einem Käfig (21x42x25 cm) in zwei gleich große Abschnitte durch eine Trennwand mit Tür (Ohara & Co., Tokyo) unterteilt.
2. Mäuse sind drei vor vier pro Käfig in einem Zimmer untergebracht mit einem 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus (Licht an um 07.00 Uhr) mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser. Im Idealfall sind zwei Kontrollen und zwei Mutanten zusammen, durch Neuordnung der Mäuse, sobald sie zum Zeitpunkt der Entwöhnung sind genotypisiert untergebracht. Behavioral Tests erfolgt zwischen 9:00 Uhr durchgeführt und 06.00 Uhr alle Käfige mit Mäusen, um das Verhalten Testraum sind 30 min übertragen, bevor der erste Prozess beginnt.
3. Eine Kammer ist hell mit weißen Dioden (390 lux) beleuchtet, während die andere Kammer ist dunkel (2 Lux). Mäuse sind in der dunklen Seite gelegt und die Tür wird automatisch 3 Sekunden geöffnet, nachdem die Maus von der Infrarotkamera erkannt wird. Die Tür ist so, dass die Mäuse nicht in die Lichtkammer unmittelbar nach der Veröffentlichung mit ihrer Motivation, von Experimentator zu entkommen, da die Latenzzeit bis zum Lichtkammer geben als ein Index von Angst-ähnliches Verhalten dienen können verwendet werden.
4. Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen zwischen den beiden Kammern mit offener Tür für 10 min. Die Anwendung zur Erfassung und Analyse der Verhaltensdaten (Bild LD4) verwendet wird, auf den öffentlichen Bereich Image J-Programm (entwickelt byWayne Rasband am National Institute of Mental Health und unter http://rsb.info.nih.gov/ij Basis /), die von Tsuyoshi Miyakawa (verfügbar über O'Hara & Co., Tokyo, Japan) geändert wurde.
5. Die Strecke in jeder Kammer, die Gesamtzahl der Übergänge, verbrachte die Zeit in der jeder Kammer, und die Latenzzeit, das Licht chamberare von Image LD4 Programm aufgezeichnet geben.
6. Nach jedem Versuch sind alle Kammern mit super unterchlorige Wasser gereinigt, um eine Vorspannung auf Geruchssinn Basis zu verhindern.

Discussion

Obwohl alle Maus-Genom-Sequenzen bestimmt wurden, sind die Funktionen der meisten dieser Gene nicht bekannt. Gene-Targeting-Techniken kann jedoch verwendet werden, um zu löschen oder manipulieren ein bestimmtes Gen in Mäusen (Aiba et al, 2007.; Austin et al, 2004.) Werden. Der Einfluss eines bestimmten Gens zu einem bestimmten Verhalten kann dann durch die Durchführung Verhaltensanalysen des mutierten Mäusen (.; Takao et al, 2007 Takao und Miyakawa, 2006) ermittelt werden. Als Test für die Verhaltens-Phänotypisierung von Mausmutanten, die Hell / Dunkel-Übergangs-Test einer der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen (Crawley, 2000) zu messen. Der Test basiert auf der natürlichen Abneigung der Mäuse zu hell beleuchteten Bereichen und auf ihre spontane Erkundungsverhalten in neue Umgebungen (Crawley, 1985) basiert. Der Test ist empfindlich auf anxiolytische medikamentöse Behandlung (Crawley, 1985). Der Apparat besteht aus einer dunklen Kammer und eine hell erleuchtete Kammer. Eine eingeschränkte Öffnung, 3 cm hoch und 5 cm breit, verbindet die beiden Kammern. Mäuse sind erlaubt, sich frei bewegen zwischen den beiden Kammern. Die Anzahl der Einträge in das helle Kammer und die Dauer der Zeit gibt es in Form von Indizes von hell-Raum Angst in Mäusen verwendet.

Der Hell / Dunkel-Übergangs-Test wurde ursprünglich von Crawley und Kollegen (Crawley und Goodwin, 1980) entwickelt. Es gibt zwei Unterschiede zwischen der Originalfassung und unser Test. Zuerst wird das Licht Kammer größer als die dunkle Kammer, in der ursprünglichen Version, während die Größe der beiden Kammern ist der selbe in unserer Version des Tests. Zweitens, in der ursprünglichen Fassung hatte der Lichtkammer keine Decke und den Wänden der Lichtkammer wurden transparent (Crawley und Goodwin, 1980), während wir Deckweiß Kunststoff für die Decke und den Wänden der Lichtkammer verwenden. Diese Unterschiede, nämlich die Größe und die Offenheit der Lichtkammer, für den gleichzeitigen Nachweis von hell-Raum Angst sowie Open-Space-Angst in der ursprünglichen Version des Tests zu ermöglichen. In unserem Labor, aber Open-Space-Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen in einer erhöhten Plus-Labyrinth getestet. Das undurchsichtige Wände und die Decke, Größe der Lichtkammer und unsere spezifischen hell / dunkel Übergang Testprotokoll ist spezialisierter zum Nachweis von hell-Raum-Angst im Vergleich zu der ursprünglichen Version.

Obwohl die Hell / Dunkel-Übergangs-Test und erhöhten Plus-Labyrinth sowohl für die Beurteilung der Angst-Verhalten eingesetzt werden, sind die Ergebnisse nicht immer konsistent. Zum Beispiel verbringen Vorderhirn-spezifischen Calcineurin knockout Mäuse eine verringerte Menge an Zeit in das Licht Kammer in der Hell / Dunkel-Übergangs-Test, sondern eine erhöhte Menge an Zeit in die offenen Arme in die Elevated Plus Maze (Miyakawa et al., 2003) . Wir stellten die Hypothese, dass unsere Hell / Dunkel-Übergangs-Test und erhöhten Plus-Labyrinth-Tests unterschiedliche Aspekte von Angst-ähnliches Verhalten, wie hell-Raum Angst und Open-Space-Angst-ähnliches Verhalten zu beurteilen. Um diese Hypothese zu testen, haben wir eine große Datenmenge gesammelt mit den gleichen Mäusen in beiden Tests. In unserem Labor führen wir Verhaltenstest Batterien, die viele Domains auf dem Bildschirm für die Verhaltens Bedeutung der Gene. Die Testbatterie erfordert mehrere Wochen dauern. Während der Testphase werden Mäusekäfige auf einem Gestell in unserer Einrichtung aufbewahrt. Wenn Mäuse an unser Labor von anderen Institutionen transportiert werden, sind sie für die Umwelt unserer Anlage für mindestens 1 Woche gewöhnt. Nach der Gewöhnung Zeitraum, sind Mäuse, eine allgemeine Gesundheits-Check und neurologischen Screening (Miyakawa et al., 2003) unterzogen, und nach dieser einfachen Untersuchungen, Mäuse sind die Hell / Dunkel-Übergangs-Test unterzogen. Der Test wird in einer schalldichten experimentellen Raum nach 30 min der Gewöhnung an die experimentellen Raum durchgeführt, wie im Film gezeigt.

Wir haben mehr als 60 Stämme von gentechnisch mutierten Mäusen unter Verwendung des Protokolls in dem Film gezeigt, bewertet und haben eine große Menge von Rohdaten für mehr als 3000 Mäuse (einschließlich Wildtyp-und mutierten Mäusen). Wir haben Faktorenanalysen, die Vorteile der großen Menge von Rohdaten zu nehmen. Tatsächlich entdeckten wir verschiedene Faktoren, die von jedem Test (unveröffentlichte Daten), obwohl es einige signifikante Korrelationen zwischen den Indizes (unveröffentlichte Daten) .. Diese Daten werden im Rahmen einer öffentlichen Datenbank, die wir jetzt bauen werden offen gelegt werden.

In unserem Test-Batterie sind Wildtyp-Geschwister in der Regel als Kontrolle verwendet. Als Hintergrund-Stamm, sind C57BL/6J-Mäuse häufig verwendet. Wir sammelten die Daten von C57BL/6J-Mäuse als Kontrolle von Mausmutanten in der Testbatterie verwendet. Die Indizes von C57BL/6J-Mäuse in unserem hell / dunkel Übergang Test waren wie folgt (n = 795; bedeuten, SEM); Strecke: 846,5 8.88 cm im Lichte Kammer, 1478,5 9,53 cm in die dunkle Kammer, Dauer der Zeit : 215,8 1.85 Š in das Licht, 395,8 1,86 s im Dunkeln; Anzahl der Übergänge zwischen den Kammern: 30.52 0,43; Latenz, um das Licht Kammer eintreten: 64,94 2,40 s. Die Bewegung der Maus rund um die Eingänge zu den Kammern wird von der Kamera erkannt wird und im Laufe der Zeit in beide c verbracht gezähltHambers. Aus diesem Grund verbrachte die Summe der mittleren Dauer der Zeit in das Licht und die, die in dunklen Kammern war größer als die der gesamten Dauer des Tests (600 s).

In unserem Protokoll ist eine Maus zuerst in die dunkle Kammer platziert. Drei Sekunden nachdem Sie mit der Maus in die dunkle Kammer, die Tür zwischen den Kammern automatisch geöffnet und die Maus frei bewegen kann zwischen den beiden Kammern. C57BL/6J-Mäuse verbringen weniger Zeit in das Licht Kammer als in der dunklen Kammer (p <0,0001, Dauer, wenn die Zeit in Licht verbracht: 215,8 1.85 Š, der Dauer der Zeit in dunklen verbracht: 316,3 2,11 s [die Zeit im Dunkeln verbracht hat nicht die erste Zeit in der Dunkelheit vor dem Eintritt in die Lichtkammer zum ersten Mal], n = 795, gepaarten t-Test) ausgegeben. Dies deutet darauf hin, dass C57BL/6J-Mäuse die Lichtkammer meiden, und dass die Zeit in das Licht ist ein guter Index der Angst-ähnliches Verhalten.

Die Ergebnisse aus verschiedenen Stämmen von mutierten Mäusen gewonnen werden leicht verglichen werden, da alle erhaltenen Daten sind mit dem gleichen Protokoll. Um Phänotypisierung Ergebnisse eines Stammes von mutierten Mäusen, die leicht reproduzierbar und im Vergleich mit Daten von anderen Mutanten, sollte das Verhalten Prüfverfahren werden so identisch wie möglich zwischen den Laboratorien. Crabbe und seine Kollegen testeten die Interaktion zwischen Verhalten der Maus und Labor-Umgebung mit genau der gleichen Inzuchtstämme und eine Null-Mutante. In ihrer Studie wurden die Apparate, Prüfprotokolle und viele Umgebungsvariablen streng standardisiert. Trotz der Standardisierung, fanden sie eine systematische Unterschiede im Verhalten zwischen Laboratorien, obwohl sie erkannt auch unterschiedliche Stämme in alle Verhaltensweisen (Crabbe et al., 1999). Sie berichteten, dass unkontrollierbare Variablen und Experimente charakterisieren Mutanten können die Ergebnisse, dass idiosynkratische zu einem bestimmten Labor ergeben. Die verfahrensrechtlichen Unterschiede zwischen den Labors gibt es schwierig zu replizieren oder vergleichen Sie die Ergebnisse von Labor zu Labor. Hier präsentieren wir unsere Protokoll für die Hell / Dunkel-Übergangs-Test als einen Film, so dass die Details des Protokolls nachgewiesen werden kann.

Gründung visuelle Dokumentation des Protokolls wird eine bessere Verständigung über die Einzelheiten der experimentellen Verfahren, ermöglicht eine Standardisierung der Protokolle über Labors und für Vergleiche des Verhaltens Phänotypen verschiedener Stämme von mutierten Mäusen beurteilten mit Hilfe dieses Tests. Filme von anderen Protokollen, wie zum Beispiel für die erhöhten Plus-Labyrinth, offene Feldversuch Porsolt Forced Swim Test, Angstkonditionierung, dass wir in unserem Verhalten Testbatterie werden derzeit zur Veröffentlichung als zukünftige Video Zeitschriftenartikeln gemacht.