Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea

Summary

En este protocolo, se muestra cómo fabricar y tetrodos condición para su uso con una amplia micro-drive, que fue diseñado para la crónica registros electrofisiológicos en las ratas. Además, se ilustran las etapas finales de construcción de micro-array de unidad, que incluye la instalación de cables de tierra y un cono de protección.

Abstract

El tetrodo, un paquete de cuatro electrodos, ha demostrado ser una valiosa herramienta para la grabación simultánea de múltiples neuronas in vivo. La amplitud de la diferencia de las firmas del potencial de acción sobre los canales de un tetrodo permite el aislamiento de la actividad de una sola unidad de las señales de múltiples unidades. La capacidad de controlar con precisión la localización estereotáxica y la profundidad de la tetrodo es fundamental para el estudio de la actividad neuronal coordinada en todas las regiones del cerebro. En combinación con un array de micro-, es posible lograr una colocación precisa y un control estable de tetrodos muchos a lo largo de días o semanas. En este protocolo, se demuestra cómo fabricar y tetrodos condición usando las herramientas básicas y materiales, instalar el tetrodos en una matriz de tetrodo de varias unidades de las enfermedades crónicas en vivo la grabación en la rata, hacer conexiones cable a tierra a la matriz de micro-drive, y colocar un cono de protección en serie de la unidad de micro-con el fin de proteger a los tetrodos de contacto físico con el medio ambiente.

Protocol

1. Fabricación de tetrodos

1. Iniciar la construcción de un tetrodo obteniendo una longitud de 50 cm, con aislamiento de poliamida, ni cromo alambre con un núcleo de 12,5 micrones de diámetro. Doble el alambre a la mitad. Corra sus dedos a lo largo de la pareja para que se peguen entre sí. Asegúrese de que el par de hilos de tener un buen contacto en toda su longitud.
2. Veces el par de nuevo por la celebración de los dos extremos. Asegúrese de que el bucle formado en un extremo no está doblado. Cortar los cuatro cables en el extremo no bucle de modo que las cuatro extremidades están alineados.
3. Para el siguiente paso, se necesita una pinza modificada, un dispositivo de giro de motor, y una barra horizontal sobre el dispositivo de giro. La pinza se ve modificada por una barra de plástico pegado a la base del gancho. Donde las puntas de alambre se exponen, pinza de los cuatro cables con la pinza modificada. Colgar el circuito de los cables sobre la barra horizontal. Coloque la pinza en la etapa motorizada.
4. Aplicar 80 sabios reloj giros seguidos de 40 vueltas en sentido horario contrario al conjunto de cable a lo largo de aproximadamente tres minutos. Estos parámetros pueden variar de acuerdo a sus necesidades.
5. Después de girar tetrodo se ha completado, se fusionan los cables juntos por el calentamiento desde tres ángulos diferentes con una pistola de aire caliente (420 ° C o 790 º F), el uso medio-bajo flujo. Para cada ángulo, empezar a 1-2 cm por debajo de donde el conjunto de cable se divide, ejecute la pistola de calor hacia arriba y abajo a una distancia de 2 cm de los cables durante unos 5 segundos. Tenga cuidado como las altas temperaturas se derrita por completo el aislamiento y provocar cortocircuitos.
6. Ahora que los cables se han fusionado, retire el tetrodo del aparato girando con cuidado, levantando la pinza para aliviar la tensión en el tetrodo, y cortar el tetrodo cerca de la pinza. En el otro extremo, corte el lazo de tal manera que hay cuatro líneas no en condiciones de servidumbre de cables de igual longitud.
7. A continuación, separar las hebras individuales en la parte superior con cuidado doblar los cables con unas pinzas de punta suave.
8. El tetrodo ya está listo para la carga en la matriz de micro-drive. Haga 21 para 25 más tetrodos y guárdelas en una caja libre de polvo hasta que es hora de que el proceso de carga tetrodo.

2. Carga de la tetrodos y cables de tierra en la matriz de micro-disco

1. Para continuar, se necesita un total de micro-array de unidades. Si usted todavía no ha construido una, consulte el vídeo de "micro-array de unidades para la crónica en vivo de grabación:. Fabricación de la unidad" En nuestro plan de diseño, el tetrodo se adjuntará en un extremo al conector de hardware, y se ejecutarán a través del tubo portador de poliamida en la unidad de micro-tal que la punta del electrodo se extienden por debajo de la base de la matriz de micro-drive.
2. Antes de comenzar, crear un soporte de unidad que se puede conectar a la tarjeta de conexión en un extremo, y en el otro extremo, se pueden fijar por un Panavise. En este ejemplo, el titular de la unidad es un conector de Mill-Max pegado a un extremo de un mango de cuchilla tipo cutter (Figura 1c).
3. La celebración de la tetrodo con unas pinzas de punta suave y utilizando un estereoscopio, empuje la punta de la tetrodo en la poliimida tubo portador de una de las unidades micro. Empuje el tetrodo en el tubo hasta que los cables de electrodos individuales están cerca de la tarjeta de conexión en la parte superior de la matriz unidad. Tenga cuidado de no doblar o doblar los alambres, lo que hará que el tetrodo para entrar en el cerebro en un ángulo, en lugar de perpendicular, y se debilita la integridad de la tetrodo.
4. Suavemente alimentar al otro extremo de los cuatro cables en sus respectivos agujeros en la placa de interfaz electrodo usando pinzas de punta suave. Una vez más, evitar torceduras o doblar los alambres. Con los cuatro cables en su lugar, empuje los pines de oro en sus agujeros con un par de pinzas que tienen una mandíbula inferior acortado. Cuando se aprietan en el agujero, se tira el aislamiento del cable y crear una conexión eléctrica.
5. Para referencia posterior, realizar un seguimiento de la correspondencia entre micro-unidades y la posición del pasador de la tarjeta de interfaz de los electrodos.
6. Continuar cargando un total de 18 tetrodos. Las otras tres micro-unidades de la matriz se utilizará para alojar a los electrodos de referencia. Cada electrodo de referencia es de un tetrodo que utiliza sólo uno de los cuatro extremos de los cables no adherentes. Para conectar los electrodos de referencia, siga el procedimiento de carga, pero sólo conectar uno de los cuatro electrodos a la clavija del electrodo de referencia correspondiente en la tarjeta de conexión.
7. Si usted está planeando grabaciones multi-sitio, puede ser útil para planificar las conexiones de los tetrodos al conector de la tarjeta antes de tiempo. Esto debería reducir al mínimo la posibilidad de ajustar el tetrodo mal durante los experimentos.
8. Una vez que carga tetrodo se ha completado, hacer dos cables de tierra, uno de los animales y otra para el cono de protección. Corte un 6 pies de largo cable aislado de acero (texto: 0,005 "de diámetro) y eliminar 3 mm de aislamiento, con unas pinzas de metal, desde cada extremo del cable. A continuación, corte de 4"Aceros largos cables aislados (texto: 0,005" de diámetro). Eliminar 3 mm de aislamiento en un extremo y 1 cm en el otro extremo.
9. Ruta de cable de 6 'del suelo a través del agujero en el lado de la unidad matriz de micro-y hacia la tarjeta de interfaz. Conecte el cable expuesto a la tarjeta de interfaz electrodo con un broche de oro en el hoyo de tierra designado. Este cable se conecta al cráneo del animal.
10. Ruta paralela de tierra de 4 'de cable al cable de tierra instalado previamente. Conecte el extremo 3 mm despojado de la tarjeta de interfaz electrodo con un broche de oro a otro hoyo de tierra designado. Este cable luego se conecta a un cono de protección, que actuará como una jaula de Faraday pequeña para reducir la captación de ruido. Ahora estamos terminados los cables de conexión y se puede proceder a refinar nuestra tetrodos.

3. Ajuste de la longitud de la tetrodos

1. Nuestro objetivo en este proceso es cortar todos los tetrodos para que sean ligeramente más largo que la profundidad de la estructura del cerebro de destino. En nuestro ejemplo, las unidades de micro-están diseñados para un recorrido máximo de 6.5 mm, suficiente para llegar a muchas áreas neocorticales y del hipocampo dorsal de una rata adulta. En primer lugar, reducir todas las unidades de micro-para que los tetrodos son máximamente expuesta. Al mismo tiempo cortar todos los tetrodos de longitudes que son aproximadamente 5 mm más largo que la longitud final deseada usando un par de afiladas tijeras finas.
2. Para el corte final, preparar un par de tijeras dentadas en un Panavise. Abrazadera de un mango con una ligera inclinación hacia abajo y con dientes hacia arriba, dejando la manija otra colgando.
3. Ahora retirarse completamente todas las tetrodos en la cánula guía girando los discos micro-up.
4. El uso de un estereoscopio, extienda completamente un tetrodo fuera de su cánula. Con una regla, la posición de las tijeras dentadas a la distancia deseada de la cánula guía. Lenta y suavemente cortar el tetrodo con un movimiento suave. Después de este tetrodo se ha reducido, retirar el micro-disco por 3 a 4 mm. Repita este proceso para cada tetrodo hasta que todos hayan sido cortadas. En este punto, usted está listo para chapado en oro.

4. Oro chapado de tetrodos y control de calidad

Blindaje de los cables tetrodo nicrom es fundamental para largas grabaciones de estable a largo plazo. Se evita la corrosión y mejora la biocompatibilidad.

1. Configuración del medidor de impedancia en el modo externo y el generador de corriente en modo de comprobación de CC con salida de audio (Figura 1d). Tocar los dos cables del generador de corriente de los seis posibles pares de canales dentro de cada tetrodo, y utilizar la retroalimentación de audio para determinar si existen cortocircuitos entre pares. Si existe un cortocircuito, vuelva a cortar el tetrodo con tijeras dentadas y prueba de nuevo. Si el problema persiste, deseche el tetrodo y reemplazarlo.
2. Cuando no existen cortocircuitos dentro de todos los tetrodos, mover todos los discos micro-down, que se extiende a todos los tetrodos tan lejos como sea posible.
3. Modificar la configuración del equipo para el control de impedancia del electrodo (Figura 1e). Ahora moje la punta de todos los tetrodos en un baño de estándar dorado solución. El baño de oro está conectado eléctricamente con el polo positivo del medidor de impedancia. Compruebe la impedancia del electrodo tocando el cable negativo del medidor de impedancia para el correspondiente pin de la tarjeta de conexión.
4. Medir y registrar la impedancia de cada cable en la matriz de micro-drive. Los valores normales van de 1.3 Mohm.
5. En el generador de corriente, ajuste la corriente entre 3.1 mA. A continuación, fije firmemente el cable negativo del medidor de impedancia para el pin en el conector de la tarjeta. Coloque el equipo en la configuración de galvanoplastia (Figura 1f). En el medidor de impedancia, cambiar rápidamente de modo normal, a modo de bypass, y la espalda. Mientras que en el modo de derivación, la corriente pasará a través del tetrodo y disolución de oro y el oro se sembraron en la punta del electrodo. La impedancia después de cada ronda de las planchas debe ser menor que antes. Repita el impulso de corriente si la impedancia de no caer por debajo de 1 MOhm. Una gran conservador de impedancias aceptables 250kOhm a 350 kOhm. Si la impedancia cae por debajo de 200 kOhm, esto puede indicar un corto circuito.
6. Si después de repetidos pulsos de la impedancia no baja lo suficiente, la punta del electrodo puede ser obstruida. Vuelva a cortar el tetrodo, compruebe si hay pantalones cortos, y repetir el proceso de dorado. Si re-corte no resuelve el problema, reemplace el tetrodo y empezar de nuevo.
7. Después de sembrar todos los tetrodos Sumerja la punta tetrodo brevemente en etanol, y déjelos secar durante 3 a 5 minutos.
8. Prueba de cortocircuitos en tetrodos utilizando el generador de corriente con las puntas tetrodo se expone al aire. Si una conexión de CC existe entre dos o más electrodos de un tetrodo, vuelva a cortar el tetrodo, y la placa de oro de nuevo.
9. Después de sobrerregulación de todos los tetrodos es completa, agregar una gota de espesor medio de ciano-acrilato de cola a la interfaz entre cada tetrode y su tubo de poliamida. Esto asegurará la tetrodo a su micro-drive y mantener la longitud de la tetrodo.
10. Como paso final, se mueven todos los tetrodos en la unidad girando todos los tornillos de arriba.

5. Colocación del cono de protección

El propósito del cono de protección es para proteger a las micro-unidades y el cable tetrodo expuestos desde el medio ambiente. También proporciona soporte para el manejo durante un experimento y reduce el ruido eléctrico. Utilizamos un 3-D cono de plástico impresas (Parte I Referencia: fabricación de la unidad). Sin embargo, es posible hacer el cono de otros materiales, como una parte inclinada de la lata de refresco.

1. Tome el cono de plástico y fijar un poco de cinta de papel de aluminio a la superficie interna o externa.
2. A continuación, un agujero pequeño (1,5 mm de diámetro) a través del cono y libremente fijar un tornillo con una arandela y tuerca en el interior del cono. Esto servirá como un paso eléctrico para el conductor de tierra. Le recomendamos que utilice un tornillo de tamaño de 00 a 80 y una combinación de lavadora.
3. En primer lugar, insertar y en parte a su vez tres tornillos de tamaño 1-72 (3 / 16 pulgadas de largo) en los lados del cono. Con el array de unidades suspendidas, inserte el cono sobre la unidad. Asegúrese de que tanto los cables de tierra se extienden desde la parte inferior de la matriz unidad. Envuelva la parte expuesta del cable de tierra de 4 'en torno a uno de los tornillos de 1-72 en varias ocasiones y apriete el tornillo firmemente. Fije el cono a la base de la unidad apretando los dos tornillos restantes cono.
4. Por último, tome la 1 cm extremo pelado del cable de tierra de corto y el viento que todo el tornillo, en medio de la cinta de papel de aluminio y lavadora. Asegure el suelo apretando el tornillo. Ahora tenemos una serie de micro-unidad que está por fin listo para su implantación quirúrgica.

6. Los resultados representativos

1. Micro-drive de producción conjunto se ha completado. Su micro-array de unidades se ha cargado con 18 tetrodos y 3 canales de referencia. Éste queda encerrado en un cono de protección y la tapa para una mayor durabilidad. El acabado micro-array de unidades con el cono de protección pesa 20 gramos a 25 gramos en promedio.
2. La Orden unidad de disco terminado se implanta mediante el procedimiento quirúrgico estándar. Como puede ver, la unidad está conectada a un chip de preamplificador y un manojo de cables que transportan la señal de hardware de adquisición de datos y software.

Figura 1: Esquema) de la configuración de torsión tetrodo. Una barra horizontal suspende los cables de los electrodos no adherentes de la tetrodo por encima del dispositivo tetrodo giro automático. B) La instalación de medición de la impedancia tetrodo y las planchas del electrodo. Al verificar si hay cortocircuitos, el circuito es diferente:. El cable negro se conecta a otro canal de electrodos en la placa de conexión C) Un primer plano de un encargo a micro-disco portaherramientas matriz. La barra cilíndrica es un mango de un cuchillo de X-Acto. El conector es de 26 pines, de dos hileras, Mill-Max conector. Las dos piezas se unen con acrílico dental. D) de configuración para el control de corto plazo. Canal X e Y son dos canales diferentes canales de los cuatro canales tetrodo. E) Configuración para la medición de impedancia del electrodo. La fuente de corriente es 'off'. El medidor de impedancia está en 'on' y 'test'. F) de configuración para chapado en oro de puntas de los electrodos. La fuente actual se establece en "on", el audio es "on", el modo es "unipolar", de prueba de CC está "encendido", la corriente se establece en 2 microamperios.

Discussion

Este protocolo es la segunda entrega de un protocolo de dos partes: "Micro-array de unidades de las enfermedades crónicas en vivo la grabación." La combinación de la matriz de la unidad de micro-y tetrodo es una poderosa herramienta para la obtención de registros simultáneos de muchas neuronas en una vigilia, comporta la preparación de los animales. Esperemos que le hemos proporcionado toda la información necesaria para que usted tendrá que iniciar o mejorar los registros electrofisiológicos en su propio laboratorio.

El motor tetrodo dispositivo tornado fue diseñado y fabricado. Hemos proporcionado un número de proveedor y la parte que le permiten ordenar un dispositivo con una funcionalidad similar. Por otra parte, un dispositivo de giro motorizado puede ser construido en la casa simplemente mediante la combinación de un imán giratorio motorizado bar con una barra magnetizada de agitación que se adjunta a una pinza, esta configuración más probable es que requiere el conteo manual de las rotaciones, la reversión manual de sentido de rotación, y el manual de arranque / parada.

Algunas tarjetas de interfaz electrodo no tienen pin-hole y mecanismos para la conexión del cable de electrodos. En su lugar, puede haber obtenido una interfaz que tiene patillas de metal que se extienden desde la placa de conexión, pernos metálicos tales son similares a los que se suelen encontrar en los componentes electrónicos estándar. Haremos una breve esbozo de una metodología para la conexión de los canales de tetrodo a las patillas de metal. En primer lugar, eliminar el aislamiento de las puntas de los cuatro cables de los electrodos de cada tetrodo. Esto se logra mediante la aplicación de una llama en la punta de cada electrodo lo más brevemente posible con una antorcha de butano de mano. Obtener retractilado que se ajuste fácilmente a través de la espiga de metal, y apriete el perno con fuerza después de la envoltura se ha calentado. Cortar el tubo del envoltorio a la longitud de la espiga de metal. Use la acción capilar para llenar el envoltorio plástico con pintura plateada. Inserte la punta expuesta de un alambre del electrodo en el envoltorio. Deslice suavemente la envoltura sobre el pasador de metal de tal manera que el cable del electrodo está entre el pasador y la pared de la envoltura. Repita estos pasos para los canales de electrodos tres restantes de la tetrodo. Por último, con un movimiento de lado a lado de una pistola de calor, el calor de las cuatro clavijas cubierto de envoltorio (con los cables de los electrodos en el interior del envoltorio). En este punto, usted debe tener conexiones estables y confiables entre el tetrodo y tarjeta de conexión.

A lo largo de estos procedimientos de fabricación de manejar los cables de los electrodos con cuidado, ya muy poca fuerza tiene la obligación de hacerles daño. Hay muchos pasos en el tetrodo y micro-drive procedimiento de arreglo y cada paso es tan importante como los otros para la obtención de datos de alta calidad. El protocolo descrito aquí ha funcionado bien para nuestro laboratorio teniendo en cuenta el equipo disponible. Los recursos en su propio laboratorio pueden ser diferentes, por lo tanto, considerar cada paso cuidadosamente y no dude en cambiar el protocolo para satisfacer sus propias necesidades y las limitaciones con el fin de lograr un rendimiento óptimo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.