Summary
이 프로토콜에서는 쥐에서 만성 electrophysiological 레코딩을 위해 설계되었습니다 마이크로 드라이브 어레이와 함께 사용하기 위해 조작 및 조건 tetrodes하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 지상 설치 와이어 및 보호 원추형을 포함 마이크로 드라이브 배열 건설의 마지막 단계를 보여줍니다.
Abstract
tetrode, 넷 전극의 번들, - 생체내 여러 뉴런의 동시 녹음 가치있는 도구로 입증되었습니다. tetrode의 채널을 통해 행동 가능성이 서명의 차동 진폭 멀티 유닛 신호의 단일 유닛 활동의 절연을 허용합니다. 정확하게 tetrode의 stereotaxic 위치와 깊이를 제어하는 능력은 두뇌의 지역에 걸쳐 조정 신경 활동을 공부에 중요합니다. 마이크로 드라이브 어레이와 함께, 그것은 주 일 과정을 통해 정확한 배치와 많은 tetrodes의 안정적인 제어를 달성하는 것이 가능합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 조작 및 기본 도구와 재료를 사용하여 조건 tetrodes은, 만성의 멀티 드라이브 tetrode 배열에 tetrodes를 설치하는 방법을 보여줍니다 인 생체내 밀고에서 녹음, 마이크로 드라이브 배열 접지 와이어 연결을 확인하고, 환경과 물리적인 접촉에서 tetrodes를 보호하기 위해 마이크로 드라이브 어레이에 보호 원추형을 이메일에 첨부해주십시오.
Protocol
1. tetrodes의 제작
- NI - 크롬 와이어 12.5 마이크론 직경 코어와 절연 polyimide, 길이 50cm를 취득하여 한 tetrode의 건설을 시작합니다. 절반 와이어를 접으십시오. 그들이 뭉쳐 만들 쌍을 함께 손가락을 실행합니다. 와이어의 쌍 그들의 전체 길이에 걸쳐 좋은 연락 방법을 가지고 있는지 확인하십시오.
- 함께 두 끝을 잡고 의해 다시 쌍을 접으십시오. 한쪽에 형성 루프가 kinked 있지 않은지 확인합니다. 4 가지 방법이 정렬되도록 이외의 반복 끝에있는 4 개의 선이 컷.
- 다음 단계에, 당신은 수정된 악어 클립, 전동 회전 장치 및 회전 장치 위에 수평 막대가 필요합니다. 악어 클립 gluing 클립의 기지에 플라스틱 막대에 의해 수정됩니다. 와이어 도움말이 노출되는 곳에, 수정된 악어 클립과 함께 4 개의 선이 클램프. 수평 막대를 통해 와이어 루프를 잡아. 전동 무대로 악어 클립을 배치합니다.
- 약 3 분의 과정을 통해 와이어 번들 40 카운터 시계 왜곡 다음 80 시계 왜곡을 적용합니다. 이러한 매개 변수는 여러분의 필요에 따라 다양한하실 수 있습니다.
- tetrode의 왜곡이 완료되면, 중간 - 낮은 흐름을 사용하여 열 총 (420 ° C 또는 790 ° F)의 세 가지 각도에서 가열하여 함께 전선을 융합. 각 각도 들어, 약 5 초 동안 와이어에서 2cm 거리에서 와이어 번들이 분리 아래 1~2센티미터를 시작 열 총 내려 실행하고 백업하십시오. 고온 완전히 절연 제를 용해하고 단락으로 이어질 수 있으므로주의하시기 바랍니다.
- 와이어가 함께 융합 했으므로, 부드럽게 tetrode에 긴장을 완화하기 위해 악어 클립을 리프팅하여 비틀 장치에서 tetrode를 제거하고, 악어 클립 근처 tetrode를 잘라. 다른 끝에, 동일한 길이의 와이어 네 가지가 아닌 보세 가닥이있다는 것을 같은 루프를 잘라.
- 다음, 부드럽게 부드러운 밀고 트위터와 전선을 절곡하여 상단에있는 각각의 가닥을 분리.
- tetrode 이제 마이크로 드라이브 배열로로드를위한 준비가되었습니다. 21-25 더 tetrodes을하고 tetrode 로딩 프로세스에 시간이 될때까지 먼지 무료로 상자에 그들을 저장할 수 있습니다.
2. 마이크로 드라이브 배열로 tetrodes 및 접지 전선을 로딩
- 진행하기 위해서는 완벽한 마이크로 드라이브 배열이 필요합니다. 아직 하나를 구축하지 않은 경우 '에 - 생체내 녹음 만성위한 마이크로 드라이브 배열입니다. : 드라이브 제조'비디오를 참조하십시오 전극 팁의 마이크로 드라이브 배열의 기초 아래에 연장되는에는 마이크로 드라이브 캐리어 튜브를 polyimide 우리 디자인 계획에서 tetrode는 커넥터의 하드웨어 하나의 끝에 첨부되며,을 통해 실행됩니다.
- 시작하기 전에 하나의 끝에있는 커넥터 보드에 장착할 수 있으며, 다른 끝에, panavise에 의해 고정되어 수있는 드라이브 홀더를 빌드합니다. 이 예제에서는 드라이브 홀더는 X - ACTO 나이프 핸들 (그림 1C)의 한쪽 끝을 위해 접착 밀 - 최대 커넥터입니다.
- 소프트 밀고 족집게로 tetrode를 개최하고 입체경을 사용하여에 tetrode의 끝을 밀어하면 마이크로 드라이브 중 하나의 캐리어 튜브를 polyimide. 각 전극 와이어는 드라이브 배열의 상단에있는 커넥터 보드에 가까운 때까지 튜브에 tetrode 밀어. 꼬임이나 구부 와이어,이게 오히려 수직보다 각도에서 두뇌를 입력 tetrode의 원인이되므로, 그리고 tetrode의 무결성을 약하게됩니다 않도록주의하십시오.
- 부드럽게 부드럽게 밀고 족집게를 사용하여 전극 인터페이스 보드의 해당 구멍에 4 개의 선이의 다른 쪽 끝을 피드. 다시, 와이어 꼬임이나 굽힘하지 마십시오. 대신에 4 개의 선이으로 단축 아래턱을 펜치로 자신의 구멍에 금색 핀을 밀어. 핀이 구멍에 적용됩니다 때, 그들은 와이어 절연 제를 스트립 및 전기 연결을 생성합니다.
- 나중에 참고로, 마이크로 드라이브와 전극 인터페이스 보드의 핀 위치 사이의 매핑을 추적할.
- 18 tetrodes 총 로딩 계속합니다. 배열에 세 남아있는 마이크로 드라이브는 참조 전극을 수용하는 데 사용됩니다. 각 기준 전극은 네 개의 unbonded 와이어 종료 중 하나만 사용 tetrode으로 만들어진 것입니다. , 참조 전극을 부착로드 절차를 수행하지만 커넥터 보드에서 해당 참조 전극 핀 네 개의 전극 중 하나를 첨부합니다.
- 당신은 다중 사이트 녹음을 계획하고있다면, 그것은 tetrodes에서 미리 커넥터 보드에 연결을 계획하는 가치가있을 수 있습니다. 이것은 실험을하는 동안 잘못된 tetrode 조정의 가능성을 최소화해야합니다.
- tetrode 로딩이 완료되면, 두 건의 지상 와이어, 동물 용과 보호 원추형 한합니다. 에서 6 '긴 절연 강철 와이어를 (텍스트 : 0.005'직경) 잘라 철사의 각 끝에서, 금속 핀셋을 사용하여 단열의 3mm를 제거합니다. 그렇다면 4 컷'긴 절연 강철 와이어 (텍스트 : 0.005'직경). 한 쪽 끝에 그리고 다른 끝에 1cm에서 단열재의 3mm를 제거합니다.
- 마이크로 드라이브 배열의 측면에있는 구멍을 통해 최대의 인터페이스 보드쪽으로 국도 6 '접지 와이어를. 지정된 접지 구멍에 금색 핀으로 전극 인터페이스 보드에 노출된 전선을 연결합니다. 이 와이어는 동물의 두개골에 연결됩니다.
- 이전에 설치한 접지 와이어에 국도 4 '접지 와이어 병렬. 다른 지정된 접지 구멍에 골드 핀을 사용하여 전극 인터페이스 보드에 3mm 벗겨지고 끝을 연결합니다. 이 와이어는 나중에 노이즈 픽업을 줄이기 위해 작은 패러데이 케이지 역할을하는 보호 원뿔에 연결됩니다. 우리는 지금 연결 전선을 완료하고 우리 tetrodes를 수정과 함께 진행할 수 있습니다.
3. tetrodes의 길이를 설정
- 이 과정에서 우리의 목표는 그들이 약간 이상 대상 뇌 구조의 깊이보다 있도록 모든 tetrodes를 잘라하는 것입니다. 우리의 예제에서, 마이크로 드라이브는 많은 neocortical 영역과 성인 쥐 등의 해마에 도달하는 충분한 5-6mm, 최대 여행을 위해 설계되었습니다. 첫째, tetrodes가 maximally 노출되도록 모든 마이크로 드라이브를 낮추십시오. 동시에 날카로운 좋은 가위를 사용하여 원하는 최종 길이보다 약 5mm 더 이상 길이의 모든 tetrodes를 잘라.
- 마지막 컷 들어, panavise에 톱니 가위를 준비합니다. 매달려있는 다른 핸들을 떠나면서, 약간의 각도 아래쪽과 위쪽을 향하고 잘린 한 손잡이를 고정.
- 지금은 완전히 마이크로 드라이브를 회전하여 안내 정맥에 모든 tetrodes을 철회.
- 입체경를 사용하면 완벽하게 그 정맥에서 하나 tetrode를 확장합니다. 가이드 정맥에서 원하는 거리에서 통치자, 위치 톱니 모양의 가위를 사용합니다. 천천히 그리고 부드럽게 한 부드러운 움직임과 함께 tetrode를 잘라. 이 tetrode가 절단되고 나면, 3-4밀리미터에 의해 마이크로 드라이브를 철회. 모두 잘라 때까지 각 tetrode에 대해이 과정을 반복합니다. 이 시점에서 당신은 금 도금을위한 준비가되어 있습니다.
4. tetrodes 및 품질 검사의 골드 도금
nichrome tetrode 와이어 도금 골드 장기 안정적인 레코딩을 위해 중요합니다. 그것은 부식 및 개선 biocompatibility을 방지합니다.
- 외부 모드 임피던스 미터 및 오디오 출력 (그림 1D)와 DC 검사 모드에서 현재의 발전기를 설치합니다. 각 tetrode 내에서 채널의 여섯 가능한 쌍에 현재 발전기의 두 리드를 터치하고, 반바지는 쌍 사이에 존재하는지 확인하기 위해 오디오 피드백을 사용합니다. 짧은 있으면 다시 톱니 모양의 가위와 테스트와 tetrode을 다시 절단. 문제가 지속되면, tetrode를 버리고 그것을 대체합니다.
- 아무 반바지 모든 tetrodes 내에 존재하지 때 멀리 밖으로 가능한 모든 tetrodes을 확장, 모든 마이크로 드라이브를 아래로 이동합니다.
- 전극 임피던스 (그림 1E)을 확인을위한 장비 구성을 수정합니다. 이제 모든 tetrodes의 도움말 표준 금광 도금 솔루션의 욕조에 수영. 골드 목욕은 전기 임피던스 미터의 긍정적인 리드에 연결되어 있습니다. 커넥터 보드에 해당 핀에 임피던스 측정기의 부정적인 리드를 만져 전극의 임피던스를 확인합니다.
- 측정 및 마이크로 드라이브 어레이에있는 모든 전선의 임피던스를 기록합니다. 일반 값은 1-3 MOhm의 범위.
- 현재 발전기에, 1-3 μA의 전류를 설정합니다. 다음 안전하게 커넥터 보드에 핀에 임피던스 측정기의 부정적인 리드를 연결합니다. 전기 도금 구성 (그림 1 층)에 장비를 놓습니다. 임피던스 미터에 신속하게 모드를 우회하기 위해, 정상 모드에서 전환, 그리고 다시. 바이패스 모드에있는 동안, 현재는 tetrode과 골드 솔루션을 통과하며, 금은 전극 팁에 도금 것입니다. 도금 각 라운드 후에 임피던스 전에 미만이어야한다. 임피던스 1 MOhm 아래에 드롭하지 않은 경우 전류 펄스를 반복합니다. 허용 임피던스의 보수 범위는 350 kOhm에 250kOhm 있습니다. 임피던스 200 kOhm 아래로 떨어지면,이 짧은 회로를 나타낼 수 있습니다.
- 반복 펄스 후 임피던스가 충분히 드롭하지 않는 경우, 전극 팁을 방해 수 있습니다. tetrode을 다시 절단, 반바지를 확인하고, 금 - 도금 과정을 반복합니다. 다시 절단 도움이되지 않으면 tetrode를 교체하고 다시 시작합니다.
- 모든 tetrodes을 도금 후, 에탄올에서 짧게 tetrode 도움말을 찍어, 그리고 그들이 3-5분 위해 건조하게.
- 공기에 노출 tetrode 도움말과 현재의 발전기를 사용하여 tetrodes 이내 단기 회로에 대한 테스트합니다. DC 연결 tetrode 중 두 개 이상의 전극 사이에 존재하면, 다시 황금으로 tetrode하고, 번호판을 다시는 잘라 버릴거야.
- 모든 tetrodes의 골드 도금이 완료되면 각 tetrod 사이의 인터페이스에 중간 두께 cyano - 아크릴 레이트 접착제 한 방울을 추가전자과가 튜빙 polyimide. 이것은 마이크로 드라이브에 tetrode를 확보하고 tetrode의 길이를 유지합니다.
- 마지막 단계로, 모든 나사를 회전하여 드라이브에있는 모든 tetrodes 이동합니다.
5. 보호 콘 부착
보호 콘의 목적은 환경에서 마이크로 드라이브와 노출된 tetrode 와이어를 보호하는 것입니다. 그것은 또한 실험 도중 처리에 대한 지원을 제공하고 전기 노이즈를 줄여줍니다. 우리는 3 차원 인쇄 플라스틱 콘을 (드라이브 제조 참조 부)을 사용합니다. 그러나, 그것은 할 수 소다의 구부러진 조각 같은 다른 재료의 원추형을 만들 수 있습니다.
- 플라스틱 원추형를 타고 안쪽 또는 바깥쪽 표면에 일부 알루미늄 호일 테이프를 수정.
- 다음, 원추 통해 작은 구멍 (직경 1.5 mm)을 훈련하고 느슨하게 원추 안에 세탁기와 너트와 나사를 첨부합니다. 이것은 접지 와이어에 대한 전기적 통로 역할을합니다. 우리는 00-80 사이즈 나사 및 와셔의 조합을 사용하는 것이 좋습니다.
- 첫째, 삽입 및 부분적으로 원추의 측면로 3 1-72 크기 나사 (길이 16분의 3 인치) 설정합니다. 드라이브 배열 중지로 드라이브 위에 원추형를 삽입합니다. 두 접지 와이어 드라이브 배열의 바닥에서 연장 있는지 확인하십시오. 여러 번 1-72 나사 중 하나가 주변 4 '접지 와이어의 노출된 부분을 싸서 단단히 나사를 고정. 나머지 두 원추형 나사를 강화하여 드라이브베이스에 원추형을 고정합니다.
- 마지막으로, 1cm 짧은 접지 와이어를 취소 끝을 가지고 호일 테이프와 와셔 사이에, 나사 주위를 바람. 나사를 강화하여지면을 고정합니다. 이제 우리는 마침내 외과 이식을위한 준비가 마이크로 드라이브 배열되어 있습니다.
6. 대표 결과
- 마이크로 드라이브 배열 생산이 완료되었습니다. 귀하의 마이크로 드라이브 어레이는 18 tetrodes 3 참조 채널로로드됩니다. 그것은 내구성 보호과 원추형 모자으로 쌌다입니다. 보호 콘로 끝난 마이크로 드라이브 배열은 평균 25g에 20g의 무게.
- 완료 드라이브 배열은 표준 수술을 사용하여 이식합니다. 당신이 볼 수 있듯이, 드라이브는 preamplifier 칩 및 데이터 수집 하드웨어 및 소프트웨어에 신호를 운반 전선의 묶음에 첨부되어 있습니다.
그림 1 : tetrode의 왜곡 구성의 A) 도식. 수평 막대가 자동 tetrode의 비틀림 장치 위에 tetrode의 unbonded 전극 전선을 정직 시키실. B는 tetrode 임피던스 측정 및 전극 도금)을 설치합니다. 단락을 확인할 때, 회로가 다릅니다. 검은색 와이어가 커넥터 보드에서 다른 전극 채널에 연결된 C) 클로즈업 사용자 정의의 A 마이크로 드라이브 어레이 홀더 도구했다. 원통형 막대 X - Acto 나이프 핸들입니다. 커넥터는 26 핀, 두 행, 밀 - 최대 커넥터입니다. 짧은 확인에 대한 두 가지는 치과 아크릴을 사용하여 함께 결합하고 있습니다. D) 구성. 채널 X와 Y는 채널 네 개의 tetrode 채널의 두 가지 채널이 있습니다. E)은 구성 전극 임피던스를 측정하십시오. 현재 소스는 '해제'입니다. 임피던스 측정기가 '에'와 '테스트'로 설정됩니다. F)는 전극 팁 황금 도금에 대한 구성은. 전류 소스가 '에서'오디오 '에서'입니다 설정 모드는 'unipolar'입니다, DC 테스트가 '에서'이며, 현재 2 microamps로 설정됩니다.
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Discussion
이 프로토콜은 두 부분 프로토콜의 두 번째 할부이다 : "에 - 생체내 녹음 만성위한 마이크로 드라이브 배열입니다."마이크로 드라이브 배열과 tetrode의 조합이 깨어있는 많은 뉴런의 동시 녹음을 얻기위한 강력한 도구입니다, 동물 준비 행동. 자신의 실험실에서 electrophysiological 레코딩을 시작하거나 개선하기 위해 필요한 것이다 바라건대, 우리는 필요한 모든 정보를 제공하고 있습니다.
전동 tetrode 트위스터 장치가 사용자 정의 설계 및 가공되었습니다. 우리는 비슷한 기능을 가진 장치를 위해 수있는 공급 업체 및 부품 번호를 제공하고 있습니다. 또한, 전동 회전 장치는 단순히 악어 클립에 첨부되어 magnetized 감동 막대와 전동 회전 막대 자석을 결합하여 사내에서 건설 수 있으며,이 구성은 대부분 회전, 회전 방향의 수동 반전 카운트 설명서를 요구한다, 및 시작 / 정지 매뉴얼.
일부 전극 인터페이스 보드는 전극 와이어를 연결하기위한 핀 및 홀 메커니즘이 없습니다. 대신, 당신은 커넥터 보드에서 밖으로 확장 금속 핀이 인터페이스 보드를 얻은 수 있으며, 그러한 금속 핀은 종종 기본 전자 부품에있는 것과 비슷합니다. 우리는 간단히 금속 핀에 tetrode 채널을 연결하기위한 방법을 설명합니다. 첫째, 각 tetrode의 네 개의 전극 와이어의 끝부분에 절연을 제거합니다. 이것은 휴대용 부탄 토치를 사용하여 가능한 한 간략하게 각 전극의 끝부분에 불꽃을 적용하여 수행됩니다. 금속 핀을 통해 쉽게 맞게 포장을 축소 얻을하고 수축 포장이 가열 후 단단히 핀을 쥐어 짜기 것입니다. 금속 핀의 길이에 대한 축소 랩 튜브 컷. 은색 페인트로 축소 래핑을 채우기 위해 모세관을 사용합니다. 축소 랩 하나의 전극 와이어의 노출 팁을 넣습니다. 부드럽게 전극 와이어는 핀 및 축소 랩의 벽 사이에 이러한 금속 핀을 통해 수축 포장을 슬라이드. tetrode의 나머지 세 전극 채널에 대해 이러한 단계를 반복합니다. 마지막으로, 열 총의 사이드 - 투 - 쪽의 움직임과 함께, 열 네 개의 핀은 (수축 포장 내부의 전극 와이어 포함) 수축 포장에 있었다. 이 시점에서, 당신은 tetrode 및 커넥터 보드 사이에 안정적인 연결이 있어야합니다.
거의 강제로 그들을 손상하는 데 필요한 이러한 제작 전반에 걸쳐 절차는 신중하게 전극 전선을 취급하고 있습니다. 이 tetrode와 마이크로 드라이브 배열 절차의 많은 단계는 각 단계는 고품질의 데이터를 얻기 위해 다른만큼 중요합니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 저희 연구실이 사용할 수있는 장비를 고려에 대해 잘 근무하고 있습니다. 자신의 실험실에서 자원 다를 수 있습니다 따라서, 신중하게 각 단계를 고려하여 최적의 성능을 달성하기 위해 자신의 요구 사항 및 제약 조건을 충족하기 위해 프로토콜을 변경하는 것을 망설이지 말라.
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Acknowledgments
우리는 비디오에 묘사된 자동, 전동 tetrode 트위스터 장치 자신의 설계 및 시공에 대한 Jun 야마모토을 인정하고 싶습니다. 또한, 마이크로 드라이브와 연구실에 tetrode 기술 개발에 자신의 공헌에 대한 모든 과거와 현재 윌슨 연구소 회원을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Panavise | Tool | Panavise | Model 301 | Holds either micro-drive array or serrated scissors |
| Modified Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark Inc | 96F8903 | For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers. |
| Slow Cure Glue | Material | Great Planes (Champaign, IL) | GPMR6015 | To glue the tetrode to the micro-drive |
| Gold Plating Solution | Material | Neuralynx Inc. | Sifco Selectron Gold NC | Contains gold particles for electroplating |
| Current Generator | Tool | World Precision Instruments, Inc. | A365D-B | A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips. |
| Impedance Meter | Tool | BAK Electronics | IMP-1 / 6662 / 2788 | To check impedance of electrodes |
| Hot Air Gun | Tool | Steinel (Germany) | HG 3002 LCD | To fuse electrodes together to make tetrode |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven | 18768 (Pattern 304) | For handling tetrodes |
| Alligator Clip | Tool | Fine Science Tools | 18050-35 | A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments | 25-1000 | For general cutting of tetrode/electrode wire |
| Iris Toughcut Serrated Scissors | Tool | Fine Science Tools | 14058-09 | For final cut of tetrodes |
| Teflon Coated Stainless Steel Wire | Material | A-M Systems | 790500 | Ground wire |
| 12.5 micron nichrome wire | Material | Kanthal Palm Coast | Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING | Polyimide coated micro-wire for making tetrodes. |
| Tetrode Twister | Tool | Neuralynx Inc. | Tetrode Assembly Station | Increases the speed and consistency of tetrode fabrication. |
| Silver Paint | Material | GC International | 22-023 | For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion) |
| X-Acto Knife Handle | Material | MSC Direct | X3001 | For constructing a micro-drive holding device. |
| 26 Pin, 2 Row Connector | Material | Mill-Max | 852-10-026-30-001000 | For constructing a micro-drive holding device. |
References
- Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex. J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).
