Micro-drive array per la cronica In vivo: tetrodo Assemblea

Summary

In questo protocollo dimostriamo come fabbricare e tetrodi condizione per l'utilizzo con un micro-drive array, che è stato progettato per registrazioni elettrofisiologiche cronica nei ratti. Inoltre, illustrare le fasi finali della costruzione di micro-drive array, che include l'installazione di cavi di terra e un cono protettivo.

Abstract

Il tetrodo, un fascio di quattro elettrodi, ha dimostrato di essere un prezioso strumento per la registrazione simultanea di più neuroni in vivo. L'ampiezza differenziale di firme del potenziale d'azione sui canali di un tetrodo permette l'isolamento di singole unità di attività da più unità segnali. La capacità di controllare con precisione la posizione stereotassica e la profondità della tetrodo è fondamentale per lo studio coordinato l'attività neurale in tutte le regioni del cervello. In combinazione con un micro-drive array, è possibile ottenere il posizionamento preciso e un controllo stabile di tetrodi molti nel corso di giorni o settimane. In questo protocollo, dimostriamo come fabbricare e tetrodi condizione utilizzando strumenti e materiali di base, installare il tetrodi in un multi-drive array tetrodo per la cronica in-vivo di registrazione nel ratto, le connessioni filo di terra al micro-drive array, e allegare un cono protettivo sulla serie di micro-drive per proteggere i tetrodi dal contatto fisico con l'ambiente.

Protocol

1. Fabbricazione di tetrodi

1. Iniziare la costruzione di un tetrodo ottenendo un 50 cm di lunghezza, poliammide isolati, ni-cromo filo con un nucleo di 12,5 micron di diametro. Piegare il filo a metà. Correre le dita lungo la coppia per farli stare insieme. Assicurarsi che la coppia di fili hanno un buon contatto per tutta la loro lunghezza.
2. Piegare la coppia ancora una volta tenendo insieme le due estremità. Assicurarsi che il ciclo formata da un lato non sia piegato. Tagliare i quattro fili sulla non-loop estremità in modo che le quattro punte sono allineati.
3. Per il passo successivo, avrete bisogno di un coccodrillo modificato, un dispositivo di rotazione motorizzata, e una barra orizzontale sopra il dispositivo di svolta. Il coccodrillo è stato modificato incollando una barra di plastica alla base della clip. Dove le punte del filo sono esposti, morsetto i quattro fili insieme al coccodrillo modificato. Appendere il ciclo di fili sulla barra orizzontale. Posizionare il coccodrillo nella fase motorizzato.
4. Applicare 80 in senso orario colpi di scena, seguita da 40 colpi di scena in senso orario in contrasto con il fascio cavi nel corso di circa tre minuti. Questi parametri possono essere variati secondo le vostre esigenze.
5. Dopo torsione tetrodo è completato, fondere insieme i fili da riscaldamento da tre diverse angolazioni con una pistola di calore (420 ° C o 790 ° F), con medio-basso flusso. Per ogni angolo, cominciano 1-2 cm sotto il fascio di fili in cui si divide, eseguire la pistola di calore verso il basso e fino ad una distanza di 2 cm dal filo per circa 5 secondi. Prestare attenzione, come le alte temperature si scioglieranno completamente l'isolamento e portare a corto circuiti.
6. Ora che i fili sono fusi insieme, rimuovere il tetrodo dall'apparato torsione delicatamente sollevando il coccodrillo per alleviare la tensione sul tetrodo, e tagliare il tetrodo vicino al coccodrillo. All'altra estremità, tagliare il circuito in modo tale che ci sono quattro settori non legati di filo di uguale lunghezza.
7. Quindi, separare i singoli fili in alto con delicatezza piegando i fili con una pinzetta a punta morbida.
8. Il tetrodo è pronto da caricare nel micro-drive array. Fai 21-25 più tetrodi e riporle in una scatola di polvere fino a quando non è tempo per il processo di caricamento tetrodo.

2. Caricamento dei tetrodi e fili di terra nel micro-array di unità

1. Per procedere, è necessario un completo micro-drive array. Se non hai ancora costruito uno, fare riferimento al video di 'micro-drive array per cronica in vivo di registrazione:. Fabbricazione guidare' Nel nostro piano di progettazione, il tetrodo saranno fissati ad una estremità di connettore hardware, e si svolgerà attraverso la poliimmide tubo portante nel micro-drive in modo che le punte degli elettrodi estendersi al di sotto della base del micro-drive array.
2. Prima di iniziare, costruire un supporto disco che può essere collegato al connettore della scheda da un lato, e dall'altro lato, possono essere bloccati da un Panavise. In questo esempio, l'unità è titolare di un mulino-max connettore incollato ad una estremità di un X-acto manico del coltello (Figura 1c).
3. Tenendo il tetrodo con una pinzetta a punta morbida e l'utilizzo di uno stereoscopio, spingere la punta del tetrodo in poliimmide tubo portante di uno dei micro-unità. Spingere il tetrodo nel tubo fino a quando i fili elettrodi individuali sono vicino al connettore della scheda in alto l'array di unità. Fare attenzione a non piegare o piegare i cavi, in quanto che farà sì che il tetrodo di entrare nel cervello in un angolo, piuttosto che perpendicolare, e indebolire l'integrità del tetrodo.
4. Delicatamente alimentare l'altra estremità dei quattro fili nei loro rispettivi fori nella scheda di interfaccia elettrodo utilizzando una pinzetta a punta morbida. Anche in questo caso, evitare torsioni o piegare i fili. Con tutti e quattro i fili in posizione, spingere i perni di oro in loro buchi con un paio di pinze che hanno una mascella inferiore accorciato. Quando i perni vengono spinti nel foro, si eliminerà l'isolamento del filo e creare un collegamento elettrico.
5. Per il successivo riferimento, tenere traccia della mappatura tra micro-unità e posizione del perno sulla scheda di interfaccia elettrodo.
6. Continuare a caricare un totale di 18 tetrodi. I tre restanti micro-drive sulla matrice verrà utilizzata per ospitare gli elettrodi di riferimento. Ogni elettrodo di riferimento è costituito da un tetrodo che utilizza solo una delle quattro estremità del cavo non legate. Per collegare gli elettrodi di riferimento, seguire la procedura di caricamento, ma allegare solo uno dei quattro elettrodi al pin rispettivi elettrodo di riferimento sulla scheda connettore.
7. Se avete in programma multi-sito registrazioni, può essere utile per pianificare le connessioni dal tetrodi al connettore della scheda prima del tempo. Questo dovrebbe ridurre al minimo la possibilità di regolare la tetrodo sbagliato durante gli esperimenti.
8. Una volta che il caricamento tetrodo è completato, fare due fili di terra, uno per l'animale e uno per il cono di protezione. Tagliare una 6 'lungo filo di acciaio coibentato (testo: 0,005' diametro) e rimuovere i 3 mm di isolamento, utilizzando una pinzetta in metallo, da ogni estremità del filo. Poi tagliare a 4'Filo d'acciaio lungo isolati (testo: 0,005' diametro). Rimuovere 3 millimetri di isolamento da un lato e 1 cm all'altra estremità.
9. Via cavo di terra il 6 'attraverso il foro sul lato del micro-drive array e verso la scheda di interfaccia. Collegare il filo esposto alla scheda di interfaccia elettrodo con una spilla d'oro alla buca terreno designato. Questo filo si collega al cranio dell'animale.
10. Il 4 'via cavo parallelo di terra al conduttore di terra installato in precedenza. Collegare l'estremità 3 millimetri spogliata per la scheda di interfaccia elettrodo con una spilla d'oro a un altro buco terreno designato. Questo filo sarà poi collegato ad un cono protettivo, che agirà come una gabbia di Faraday piccolo per ridurre il rumore di fondo. Ora siamo finiti fili di collegamento e può procedere con la raffinazione del nostro tetrodi.

3. Impostazione della lunghezza del tetrodi

1. Il nostro obiettivo in questo processo è quello di tagliare tutti i tetrodi in modo che siano leggermente più lungo della profondità della struttura cerebrale di destinazione. Nel nostro esempio, le micro-unità sono progettate per una corsa massima di 5-6 mm, sufficiente per raggiungere molte aree neocorticale e l'ippocampo dorsale di un topo adulto. In primo luogo, abbassare tutte le micro-unità e consente di tetrodi sono massimamente esposti. Contemporaneamente tagliare tutti i tetrodi di lunghezze che sono circa 5 mm più lunga della lunghezza desiderata finale con un paio di forbici forte multa.
2. Per il taglio finale, preparare un paio di forbici dentellate in un Panavise. Morsetto una maniglia con una leggera angolazione verso il basso e con dentellature verso l'alto, lasciando l'altra maniglia penzolante.
3. Ora completamente ritirare tutte le tetrodi nelle loro cannula guida ruotando il micro-drive up.
4. Utilizzando uno stereoscopio, estendere completamente uno tetrodo fuori dalla sua cannula. Usando una, posizione righello le forbici dentellate alla distanza desiderata dalla cannula guida. Lentamente e delicatamente tagliare il tetrodo con un movimento regolare. Dopo questo tetrodo è stata tagliata, ritirare il micro-drive da 3-4mm. Ripetere questo processo per ogni tetrodo fino a che tutti sono stati tagliati. A questo punto siete pronti per la placcatura in oro.

4. Doratura di tetrodi e controllo di qualità

Doratura i fili tetrodo nichelcromo è fondamentale per le registrazioni a lungo termine stabile. Previene la corrosione e migliora la biocompatibilità.

1. Installazione del misuratore di impedenza in modalità esterna e il generatore di corrente in modalità di controllo DC con uscita audio (Figura 1d). Toccare i due cavi della corrente del generatore per le sei possibili coppie di canali all'interno di ogni tetrodo, e utilizzare il feedback audio per stabilire se esistano cortocircuiti tra le coppie. Se esiste una breve, ri-tagliare il tetrodo con le forbici dentellate e ripetere il test. Se il problema persiste, eliminare il tetrodo e sostituirla.
2. Quando non esistono all'interno pantaloncini tutte le tetrodi, spostare tutti i micro-unità verso il basso, si estende tutte le tetrodi più lontano possibile.
3. Modificare la configurazione di apparecchiature per il controllo dell'impedenza dell'elettrodo (Fig. 1e). Ora immergere le punte di tutti i tetrodi in un bagno di standard di doratura soluzione. Il bagno d'oro è collegato elettricamente al cavo positivo del misuratore di impedenza. Controllare l'impedenza dell'elettrodo toccando il polo negativo del contatore impedenza al pin corrispondente connettore sulla scheda.
4. Misurare e registrare l'impedenza di ogni filo sulla micro-drive array. I valori normali vanno da MOhm 1-3.
5. Sul generatore di corrente, impostare la corrente tra 1-3 μA. Successivamente, in modo sicuro collegare il polo negativo del contatore impedenza al pin sulla scheda connettore. Posizionare l'apparecchiatura nella configurazione galvanica (Figura 1f). Sul misuratore di impedenza, passare rapidamente dalla modalità normale, in modalità bypass, e viceversa. In modalità bypass, la corrente passerà attraverso il tetrodo e la soluzione di oro e oro sarà placcato sulla punta dell'elettrodo. L'impedenza dopo ogni turno di placcatura dovrebbe essere inferiore rispetto a prima. Ripetere l'impulso di corrente se l'impedenza non scenda sotto l'1 MOhm. Una serie conservatore di impedenze accettabili sono 250kOhm a 350 kOhm. Se l'impedenza scende al di sotto di 200 kOhm, ciò può indicare un corto circuito.
6. Se dopo ripetuti impulsi l'impedenza non scende sufficientemente, la punta dell'elettrodo può essere ostruito. Ri-tagliare il tetrodo, verificare la presenza di cortocircuiti, e ripetere il processo di doratura. Se ri-taglio non aiuta, sostituire il tetrodo e ricominciare.
7. Dopo la placcatura tutti tetrodi, immergere le punte tetrodo brevemente in etanolo, e lasciarli asciugare per 3 a 5 minuti.
8. Test per i cortocircuiti all'interno tetrodi utilizzando il generatore di corrente con le punte tetrodo esposto all'aria. Se una connessione continua fra due o più elettrodi di un tetrodo, ri-tagliare il tetrodo, e la piastra d'oro di nuovo.
9. Dopo la doratura di tutte le tetrodi è completa, aggiungere una goccia di medio spessore ciano-acrilato colla per l'interfaccia tra ogni tetrode ed il suo poliimmide tubo. Questo garantirà il tetrodo alla sua micro-drive e di mantenere la lunghezza del tetrodo.
10. Come ultimo passo, spostare tutti i tetrodi nell'unità girando tutte le viti in su.

5. Collegamento del cono di protezione

Lo scopo del cono protettivo è di scudo micro-unità e il filo tetrodo esposti dall'ambiente. Fornisce inoltre supporto per la gestione durante un esperimento e riduce il rumore elettrico. Usiamo un 3-D cono di plastica stampata (Parte I Riferimento: fabbricazione di unità). Tuttavia, è possibile fare il cono da altri materiali, come un pezzo curvo di lattina.

1. Prendere il cono in plastica e fissare del nastro adesivo un foglio di alluminio sulla superficie interna o esterna.
2. Successivamente, praticare un piccolo foro (1,5 mm di diametro) attraverso il cono e fissare liberamente una vite con una rondella e un dado all'interno del cono. Questo servirà come un passaggio elettrica per il cavo di massa. Si consiglia di utilizzare uno 0-80 vite dimensioni e la combinazione rondella.
3. In primo luogo, inserire e parzialmente curva tre viti 1-72 dimensioni (3 / 16 cm di lunghezza) in entrambi i lati del cono. Con l'array di unità sospeso, inserire il cono sopra l'unità. Assicurarsi che entrambi i fili di terra si estendono dalla parte inferiore del array di unità. Avvolgere la parte esposta del cavo di terra del 4 'intorno a una delle viti 1-72 volte e fissare saldamente la vite. Fissare il cono alla base guidare serrando le rimanenti due viti cono.
4. Infine, prendere la 1 centimetro fine spogliato del cavo di terra breve e avvolgetele intorno alla vite, tra il nastro di alluminio e la rondella. Fissare il terreno stringendo la vite. Ora abbiamo un micro-drive array è finalmente pronto per l'impianto chirurgico.

6. Rappresentante risultati

1. Micro-drive produzione di serie è ora completa. Il tuo micro-drive array è caricato con 18 tetrodi e 3 canali di riferimento. E 'racchiuso in un cono protettivo e cappuccio per la durevolezza. Il termine di micro-array di unità con cono protettivo pesa 20g a 25g in media.
2. L'array di unità finito è impiantato utilizzando le normali procedure chirurgiche. Come potete vedere, l'unità è collegata a un chip preamplificatore e un fascio di fili che trasportano il segnale di hardware di acquisizione dati e software.

Figura 1: A) Schema di configurazione torsione tetrodo. Una barra orizzontale sospende i cavi elettrodo non legate del tetrodo sopra il dispositivo automatico torsione tetrodo. B) l'installazione di misurazione dell'impedenza dell'elettrodo tetrodo e placcature. Durante il controllo di corto circuiti, il circuito è diverso:. Il filo nero collegato a un altro canale di elettrodi sul connettore della scheda C) Un primo piano di una misura micro-drive portautensili array. La barra cilindrica è un X-Acto manico del coltello. Il connettore è un 26-pin, doppia fila, Mill-max connettore. I due pezzi sono legati tra loro con acrilico dentale. D) di configurazione per il controllo a breve. Canale X e Y sono Canale due canali diversi dei quattro canali tetrodo. E) di configurazione per la misurazione dell'impedenza dell'elettrodo. La sorgente di corrente è 'off'. Il misuratore di impedenza è impostato a 'on' e 'test'. F) di configurazione per la doratura delle punte degli elettrodi. La sorgente di corrente è impostato su 'su', l'audio è 'on', la modalità è 'unipolare', Test DC è 'on', la corrente è impostato su 2 microampere.

Discussion

Questo protocollo è la seconda rata di un protocollo in due parti: "Micro-drive array per cronica in vivo di registrazione." La combinazione di array di micro-drive e tetrodo è un potente strumento per l'ottenimento di registrazioni simultanee di molti neuroni in una veglia, comportarsi preparazione animali. Speriamo di aver fornito tutte le informazioni necessarie per voi sarà necessario iniziare o migliorare le registrazioni elettrofisiologiche nel proprio laboratorio.

Il dispositivo motorizzato tetrodo twister è stato progettato e fabbricato. Abbiamo fornito un numero di vendor e la parte che vi permetterà di ordinare un dispositivo con funzionalità simili. In alternativa, un dispositivo di rotazione motorizzata può essere costruito in casa semplicemente combinando una barra di magnete rotante motorizzata con una bacchetta magnetizzata agitazione che è collegato ad un coccodrillo; questa configurazione molto probabilmente richiederà conteggio manuale delle rotazioni, inversione manuale della direzione di rotazione, e manuale avvio / arresto.

Alcune schede di interfaccia elettrodo non hanno pin-e-hole meccanismi per il collegamento del cavo dell'elettrodo. Invece, potrebbe essere ottenuto una scheda d'interfaccia che ha perni metallici che si estendono fuori dal connettore della scheda; perni metallici, sono simili a quelli spesso si trovano su normali componenti elettronici. Abbiamo brevemente delineare una metodologia per il collegamento dei canali tetrodo a perni metallici. In primo luogo, rimuovere l'isolamento sulle punte dei quattro fili elettrodi di ogni tetrodo. Questo si ottiene applicando una fiamma alla punta di ciascun elettrodo il più brevemente possibile utilizzando una torcia portatile butano. Ottenere termoretraibile che si adatta facilmente sopra il perno di metallo, e spremere il perno strettamente dopo il termoretraibile è stato riscaldato. Tagliare il tubo termoretraibile per la lunghezza del perno metallico. Utilizzare l'azione capillare per riempire il termoretraibile con vernice argento. Inserire la punta esposta di un filo elettrodo nel termoretraibile. Far scorrere delicatamente il termoretraibile sul perno di metallo in modo che il filo elettrodo è tra il perno e la parete del termoretraibile. Ripetere questi passaggi per gli altri tre canali elettrodi del tetrodo. Infine, con un lato a lato il movimento di una pistola di calore, il calore i quattro pin coperto in termoretraibile (con i fili elettrodo all'interno del termoretraibile). A questo punto, si dovrebbe avere connessioni stabili e affidabili tra i tetrodo e asse da connettore.

Nel corso di questi fabbricazione procedure di gestire i cavi elettrodo con cura come molto piccola forza è necessario per danneggiarli. Ci sono molti passi nel tetrodo e micro-drive procedura di array e ogni passo è cruciale quanto gli altri per ottenere dati di alta qualità. Il protocollo descritto qui ha funzionato bene per il nostro laboratorio considerando le attrezzature disponibili. Le risorse nel proprio laboratorio possono essere diversi, quindi, considerare ogni passo con attenzione e non esitate a modificare il protocollo per soddisfare le proprie esigenze e dei vincoli al fine di ottenere prestazioni ottimali.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.