Micro-drive tableau pour les maladies chroniques In vivo Enregistrement: Assemblée Tétrode

Summary

Dans ce protocole, nous montrer comment fabriquer et tétrodes condition pour une utilisation avec un éventail de micro-disque, qui a été conçu pour les enregistrements électrophysiologiques chroniques chez le rat. De plus, nous illustrons les étapes finales de la construction de micro-array disque, qui comprend l'installation de câbles de terre et d'un cône de protection.

Abstract

La tétrode, un faisceau de quatre électrodes, s'est avéré être un outil précieux pour l'enregistrement simultané de plusieurs neurones in vivo. L'amplitude différentielle de signatures du potentiel d'action sur les canaux d'une tétrode permet l'isolement d'une seule unité d'activité d'unités multiples signaux. La capacité de contrôler avec précision l'emplacement stéréotaxique et la profondeur de la tétrode est essentielle pour l'étude de l'activité neurale coordonnée entre les régions du cerveau. En combinaison avec une matrice de lecteur de micro-, il est possible de réaliser un placement précis et un contrôle stable des tétrodes nombreuses au cours des jours à plusieurs semaines. Dans ce protocole, nous démontrons comment fabriquer et tétrodes condition en utilisant des outils et matériaux de base, installez le tétrodes dans un tableau tétrode multi-disques pour les maladies chroniques in vivo chez le rat d'enregistrement, faire les raccordements câble de terre à la baie de micro-disque, et joignez un cône de protection sur la matrice du disque micro-afin de protéger l'tétrodes du contact physique avec l'environnement.

Protocol

1. Fabrication de tétrodes

1. Commencer la construction d'une tétrode par l'obtention d'une longueur de 50 cm, polyimide isolés, ni chrome-fil avec un noyau 12,5 microns de diamètre. Plier le fil en demi. Passez vos doigts le long de la paire pour les faire coller ensemble. Assurez-vous que la paire de fils ont un bon contact sur toute leur longueur.
2. Pliez à nouveau la paire en tenant les deux extrémités ensemble. Assurez-vous que la boucle formée sur une extrémité n'est pas plié. Coupez les quatre fils sur l'extrémité non bouclé afin que les quatre pointes sont alignées.
3. Pour la prochaine étape, vous aurez besoin d'une pince crocodile modifié, un dispositif de retournement motorisé, et une barre horizontale au-dessus du dispositif de retournement. La pince crocodile est modifié par collage d'une barre en plastique à la base de la pince. Lorsque les conseils de fil sont exposés, pince les quatre fils avec la pince crocodile modifié. Accrochez la boucle de fils sur la barre horizontale. Placez la pince crocodile dans la platine motorisée.
4. Appliquer 80 aiguilles d'une montre rebondissements, suivis de 40 tours dans le sens horaire à l'encontre des faisceau de fils au cours d'environ trois minutes. Ces paramètres peuvent être modifiés selon vos besoins.
5. Après tordant tétrode est terminée, fusionner les fils ensemble en chauffant à partir de trois angles différents avec un pistolet thermique (420 ° C ou 790 ° F), en utilisant moyenne-faible débit. Pour chaque angle, commencent à 1-2 cm en dessous, où le faisceau de fils se sépare, exécutez le canon à chaleur haut et bas à une distance de 2 cm les fils pendant environ 5 secondes. Faites preuve de prudence car les températures élevées seront complètement fondre l'isolation et conduire à des courts-circuits.
6. Maintenant que les fils ont fusionné, retirez la tétrode de l'appareil torsion en soulevant doucement la pince crocodile pour soulager la tension sur la tétrode, et couper la tétrode à proximité de la pince crocodile. À l'autre extrémité, couper la boucle de telle sorte que, il ya quatre brins non-collé de fil de longueur égale.
7. Ensuite, séparer les brins individuels au sommet par flexion délicatement les fils avec une pince molle basculé.
8. La tétrode est maintenant prêt pour le chargement dans le tableau des micro-disque. 21 pour faire 25 de plus tétrodes et les stocker dans une boîte sans poussière jusqu'à ce qu'il soit temps pour le processus de chargement tétrode.

2. Chargement de la tétrodes et les fils de terre dans le tableau des micro-disque

1. Pour continuer, vous aurez besoin d'un micro-disque complète de tableau. Si vous n'avez pas encore construit un, reportez-vous à la vidéo «Micro-drive array pour les maladies chroniques in vivo d'enregistrement:. Entraînement de fabrication ' Dans notre plan de la conception, la tétrode sera attachée à une extrémité du connecteur du matériel, et se poursuivra à travers le polyimide tube porteur dans le lecteur de micro-tels que les pointes d'électrodes s'étendent en dessous de la base de la matrice de micro-disque.
2. Avant de commencer, de construire un porte-disque qui peut être fixé à la carte du connecteur sur une extrémité, et sur l'autre extrémité, peut être serrée par un Panavise. Dans cet exemple, le détenteur du disque est un connecteur Mill-Max collé à une extrémité d'un manche de couteau X-Acto (figure 1c).
3. En tenant la tétrode avec une pince à épiler pointe douce et en utilisant un stéréoscope, poussez la pointe de la tétrode dans le polyimide tube porteur d'un des lecteurs de micro-. Poussez la tétrode dans le tube jusqu'à ce que le fils électrodes individuelles sont proches de la carte de connexion au haut de la baie de disques. Attention à ne pas tordre ou plier le fils, comme qui causera la tétrode à entrer dans le cerveau, à un angle, plutôt que perpendiculaire, et va affaiblir l'intégrité de la tétrode.
4. Doucement nourrir l'autre extrémité des quatre fils dans leurs trous respectifs au sein du conseil d'interface électrode en utilisant une pince à épiler pointe molle. Encore une fois, éviter de le déformer ou plier les fils. Avec les quatre fils en place, poussez les broches d'or dans leurs trous avec une paire de pinces qui ont une mâchoire inférieure raccourcie. Lorsque les broches sont poussés dans le trou, ils se dénuder de fil et de créer une connexion électrique.
5. Pour référence ultérieure, de garder trace de la correspondance entre les micro-disques et position des broches sur la carte d'interface électrode.
6. Poursuivre le chargement d'un total de 18 tétrodes. Les trois autres micro-disques sur le tableau sera utilisé pour loger les électrodes de référence. Chaque électrode de référence est faite d'une tétrode qui n'utilise qu'un seul des quatre extrémités des fils non adhérents. Pour attacher les électrodes de référence, suivez la procédure de chargement mais attachent une seule des quatre électrodes à la broche électrode de référence respectives sur le connecteur de carte.
7. Si vous êtes planification multi-site des enregistrements, il peut être utile pour planifier les connexions de la tétrodes au conseil connecteur d'avance. Cela devrait minimiser la possibilité d'ajuster la tétrode mal lors des expériences.
8. Une fois le chargement tétrode est terminée, faire deux fils de terre, un pour les animaux et un pour le cône de protection. Coupez un 6 'long fil d'acier isolée (texte: 0,005 m de diamètre) et enlever 3 mm d'isolant, en utilisant une pince à épiler en métal, à partir de chaque extrémité du fil. Puis couper un 4«Fil d'acier à long isolé (texte: 0.005" de diamètre). Retirer 3 mm d'isolant à une extrémité et 1 cm à l'autre bout.
9. Route fil de terre du 6 'à travers le trou sur le côté de la matrice de micro-disque et remontée vers la carte d'interface. Connectez le fil exposé à la carte d'interface électrode avec une épingle d'or dans le trou au sol désigné. Ce fil se connecte à crâne de l'animal.
10. Route de la 4 'en parallèle le fil de terre au fil de terre préalablement installé. Connectez l'extrémité 3 mm dépouillé de la carte d'interface électrode en utilisant une épingle d'or à un autre trou-chaussée désignée. Ce fil sera ensuite connecté à un cône de protection, qui agira comme une cage de Faraday faible pour réduire les bruits parasites. Nous sommes maintenant terminé et les fils de raccordement peuvent procéder à affiner notre tétrodes.

3. Réglage de la longueur de la tétrodes

1. Notre objectif dans ce processus est de couper tous les tétrodes afin qu'ils soient légèrement plus long que la profondeur de la structure du cerveau cible. Dans notre exemple, les disques micro-sont conçus pour une course maximale de 5-6 mm, suffisante pour atteindre de nombreuses zones du néocortex et l'hippocampe dorsal d'un rat adulte. Premièrement, la baisse tous les disques micro-afin que le maximum tétrodes sont exposés. Couper simultanément tous les tétrodes aux longueurs qui sont d'environ 5 mm plus long que la longueur finale désirée à l'aide d'une paire de ciseaux pointus bien.
2. Pour le montage final, préparer une paire de ciseaux crantés dans un Panavise. Clamp une poignée avec un léger angle vers le bas et vers le haut avec des dentelures, tout en laissant l'autre poignée ballants.
3. Maintenant retirer complètement toutes les tétrodes dans leur canule guide en tournant les disques micro-up.
4. Utilisation d'un stéréoscope, totalement étendre une tétrode à partir de sa canule. En utilisant une règle, la position du ciseaux crantés à la distance souhaitée de la canule guide. Lentement et doucement coupé la tétrode avec un mouvement fluide. Après cette tétrode a été coupé, retirer le micro-disque en hausse de 3-4mm. Répétez ce processus pour chaque tétrode jusqu'à ce que tous ont été coupés. A ce point vous êtes prêt pour le placage or.

4. Dorure sur tétrodes et vérifier la qualité

Dorure des fils de nichrome tétrode est critique pour les enregistrements à long terme stable. Il empêche la corrosion et la biocompatibilité s'améliore.

1. Configuration de l'impédancemètre en mode externe et le générateur de courant en mode de contrôle continu avec une sortie audio (figure 1d). Touchez les deux fils du générateur de courant pour les six paires possibles de canaux au sein de chaque tétrode, et utiliser le feedback audio pour déterminer si des shorts existent entre les paires. Si un court existe, recoupez la tétrode aux ciseaux crantés et tester à nouveau. Si le problème persiste, jeter la tétrode et de le remplacer.
2. Lorsque les shorts existent dans tous les tétrodes, déplacer tous les disques micro-bas, s'étendant tous les tétrodes aussi loin que possible.
3. Modifier la configuration de l'équipement pour vérifier l'impédance de l'électrode (figure 1e). Maintenant tremper le bout de toutes les tétrodes dans un bain d'étalon-or-placage solution. Le bain d'or est relié électriquement à la borne positive de l'impédancemètre. Vérifiez l'impédance de l'électrode en touchant le fil négatif de l'impédancemètre à la broche correspondante sur le connecteur de carte.
4. Mesurer et enregistrer l'impédance de chaque fil sur le réseau de micro-disque. Les valeurs normales vont de MOhm 1-3.
5. Sur le générateur de courant, réglez le courant entre 1-3 uA. Ensuite, attacher solidement le fil négatif de l'impédancemètre à la broche sur le connecteur de carte. Placer l'équipement dans la configuration de galvanoplastie (Figure 1f). Sur l'impédancemètre, basculer rapidement du mode normal, en mode bypass, et le dos. Alors en mode bypass, le courant va passer par la tétrode et la solution de l'or et l'or sera plaqué sur la pointe de l'électrode. L'impédance après chaque tour de placage devrait être moins qu'avant. Répétez l'impulsion de courant si l'impédance ne descend pas en dessous de 1 MOhm. Une gamme conservatrice des impédances acceptables sont 250kOhm à 350 kOhm. Si l'impédance est inférieure à 200 kOhm, cela peut indiquer un court-circuit.
6. Si après impulsions répétées de l'impédance ne chute pas suffisamment, l'extrémité de l'électrode peut être obstrué. Recoupez les tétrode, vérifiez pour les courts métrages, et répétez le processus dorure. Si re-coupe ne vous aide pas, remplacer la tétrode et recommencer.
7. Après étalement tous les tétrodes, tremper les conseils tétrode brièvement dans l'éthanol, et les laisser sécher pendant 3 à 5 minutes.
8. Test de courts-circuits au sein tétrodes utilisant le générateur de courant avec les conseils tétrode exposés à l'air. Si une connexion cc existe entre deux ou plusieurs électrodes d'une tétrode, recoupez la tétrode, et la plaque avec de l'or à nouveau.
9. Après la dorure de tous les tétrodes est terminée, ajouter une goutte d'épaisseur de la colle cyano-acrylate moyenne à l'interface entre chaque tetrode et son tube de polyimide. Cela assurera la tétrode à ses micro-disque et de maintenir la longueur de la tétrode.
10. Comme dernière étape, déplacez tous les tétrodes dans le lecteur en tournant toutes les vis en place.

5. Fixation du cône de protection

Le cône de protection objectif est de protéger les micro-disques et le fil tétrode exposés à partir de l'environnement. Il fournit également un soutien pour la manipulation lors d'une expérience et réduit le bruit électrique. Nous utilisons un 3-D cône en plastique imprimés (Partie I de référence: la fabrication d'entraînement). Cependant, il est possible de faire le cône d'autres matériaux, comme un morceau plié de canette de soda.

1. Prenez le cône en plastique et corriger certains ruban d'aluminium à la surface intérieure ou extérieure.
2. Ensuite, percer un petit trou (1,5 mm de diamètre) à travers le cône et vaguement attachent une vis avec une rondelle et un écrou à l'intérieur du cône. Ce sera un passage électrique pour le fil de terre. Nous vous recommandons d'utiliser une vis de 00 à 80 la taille et la combinaison rondelle.
3. D'abord, insérez et partiellement virage trois vis 1-72 de taille (3 / 16 pouces de longueur) dans les côtés du cône. Avec la baie de disques suspendus, insérez le cône sur le disque. Assurez-vous que les fils de terre s'étend à partir du bas du tableau d'entraînement. Enveloppez la partie exposée de fil de terre du 4 'autour d'une des vis 1-72 à plusieurs reprises et serrer la vis serrée. Fixez le cône à la base d'entraînement en serrant les deux vis restantes cône.
4. Enfin, prendre la 1 cm extrémité dénudée du fil de terre à court et enroulez-le autour de la vis, entre le ruban métallique et une rondelle. Fixez le sol en serrant la vis. Maintenant nous avons une gamme de micro-lecteur qui est enfin prêt pour l'implantation chirurgicale.

6. Les résultats représentatifs

1. La production de micro-array disque est maintenant terminée. Votre micro-array disque est chargé avec 18 tétrodes et 3 chaînes de référence. Il est enfermé dans un cône de protection et une casquette pour la longévité. Le fini de la micro-voiture tableau avec cône de protection pèse 20g à 25g en moyenne.
2. Le tableau d'entraînement fini est implanté en utilisant la norme procédure chirurgicale. Comme vous pouvez le voir, le lecteur est connecté à une puce préamplificateur et d'un faisceau de fils qui transportent le signal vers un matériel d'acquisition de données et logiciels.

Figure 1: Un Schéma) de configuration tordant tétrode. Une barre horizontale suspend le fils électrodes non adhérents de l'tétrode dessus de l'appareil tordant tétrode automatisés. B) Installation pour la mesure d'impédance tétrode et le placage de l'électrode. Lors de la vérification pour les courts-circuits, le circuit est différent:. Le fil noir est attaché à un autre canal d'électrodes sur le connecteur de carte C) Un gros plan d'une coutume fait des micro-disque porte-outil de tableau. La barre cylindrique est une manche du couteau X-Acto. Le connecteur est un 26 broches, double rangée, Mill-Max connecteur. Les deux pièces sont collées ensemble en utilisant l'acrylique dentaire. D) de configuration pour vérifier court. Canal X et Y sont les canaux de deux canaux différents des quatre canaux tétrode. E) de configuration pour la mesure de l'impédance de l'électrode. La source de courant est 'off'. L'impédancemètre est réglé sur 'on' et 'test'. F) de configuration pour placage d'or de conseils électrode. La source de courant est réglé sur "on", l'audio est «on», le mode est «unipolaire», Test DC est «on», le courant est fixé à 2 microampères.

Discussion

Ce protocole est la deuxième tranche d'un protocole en deux parties: «Les micro-disque array pour les maladies chroniques in vivo d'enregistrement." La combinaison de la gamme du lecteur de micro-et la tétrode est un outil puissant pour obtenir des enregistrements simultanés de nombreux neurones dans un éveillé, comporte la préparation des animaux. J'espère que nous vous avons fourni toutes les informations nécessaires pour vous aurez besoin pour commencer ou améliorer les enregistrements électrophysiologiques dans votre propre laboratoire.

Le moteur tétrode twister appareil a été conçu et fabriqué sur mesure. Nous avons fourni un numéro de fournisseur et d'une partie qui vous permettra de commander un appareil avec des fonctionnalités similaires. Alternativement, un dispositif de retournement motorisé peut être construite en interne tout simplement en combinant un aimant barre rotative motorisée avec une tige magnétisée remuant qui est attaché à une pince crocodile, cette configuration serait très probablement besoin comptage manuel des rotations, inversion du sens de rotation manuelle, et le manuel de démarrage / arrêt.

Certaines cartes d'interface électrode n'ont pas à goupille et trous de mécanismes pour la connexion du fil électrode. Au lieu de cela, vous avez pu obtenir une carte d'interface qui a broches métalliques qui s'étendent à partir du connecteur de carte; broches métalliques sont similaires à celles souvent trouvé sur composants électroniques standards. Nous brièvement une méthodologie pour relier les canaux tétrode à broches métalliques. D'abord, enlever l'isolant sur les pointes des quatre fils d'électrodes de chaque tétrode. Ceci est accompli en appliquant une flamme à l'extrémité de chaque électrode, aussi brièvement que possible en utilisant une torche au butane de poche. Obtenir film rétractable qui s'adaptera facilement sur la tige métallique, et se serrer les broches hermétiquement après la pellicule rétractable a été chauffé. Couper le tube enveloppe de rétrécissement de la longueur de la tige de métal. Utilisez capillarité pour remplir la pellicule rétractable avec de la peinture argentée. Insérer la pointe exposée de l'un des fils d'électrode dans la pellicule rétractable. Faites glisser doucement la pellicule rétractable sur la broche en métal tels que le fil électrode est entre l'axe et la paroi de l'emballage plastique. Répétez ces étapes pour les trois autres canaux d'électrode de la tétrode. Enfin, avec un mouvement de côté à côté d'un pistolet thermique, la chaleur les quatre broches couvert de pellicule rétractable (avec le fils d'électrodes à l'intérieur du film thermorétractable). À ce stade, vous devriez avoir des connexions stables et fiables entre les tétrode et du conseil du connecteur.

Tout au long de ces procédures de fabrication manipuler les fils électrodes avec soin comme très peu de force est nécessaire pour les dégâts. Il ya de nombreuses étapes dans la tétrode et la procédure de micro-array disque et chaque étape est aussi importante que les autres pour obtenir des données de haute qualité. Le protocole décrit ici a bien fonctionné pour notre laboratoire compte tenu des équipements disponibles. Les ressources disponibles dans votre propre laboratoire peut être différent, par conséquent, considérer chaque étape avec soin et ne pas hésiter à changer le protocole pour répondre à vos propres exigences et les contraintes afin d'atteindre des performances optimales.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.