Micro-sürücü Kronik Array In vivo Kayıt: Tetrode Meclisi

Summary

Bu protokolde sıçanlarda kronik elektrofizyolojik kayıtlar için tasarlanmış bir mikro-sürücü dizi ile kullanılmak için imal ve durumu tetrodes nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, mikro-sürücü yüklemeden yer teller ve koruyucu bir koni içeren dizi inşaat, son aşamaya göstermektedir.

Abstract

Tetrode dört elektrot, bir paket, in vivo çoklu nöronların eş zamanlı kayıt için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Bir tetrode kanallar üzerinden aksiyon potansiyeli imzaları diferansiyel genlik çoklu ünite sinyalleri tek birim faaliyet izolasyonu sağlar. Tetrode stereotaksik yeri ve derinliği tam olarak kontrol edebilme beyin bölgeleri arasında koordineli sinirsel aktivite eğitimi için kritik öneme sahiptir. Bir mikro-drive bir dizi ile birlikte, bu hafta gün boyunca hassas yerleştirme ve birçok tetrodes istikrarlı bir kontrol elde etmek mümkündür. Bu protokol, biz imal ve temel araçları ve malzemeleri kullanarak durumu tetrodes, kronik bir çok sürücü tetrode diziye tetrodes yüklemek nasıl göstermek in vivo sıçan kayıt, mikro sürücü dizi topraklama kablosu bağlantıları yapmak, ve çevre ile fiziksel temas tetrodes korumak için koruyucu bir koni mikro sürücü dizi üzerine takın.

Protocol

1. Tetrodes imalatı

1. Ni-krom tel, yalıtımlı poliimid, 12.5 mikron çaplı çekirdekli, 50 cm uzunluğunda bir elde bir tetrode inşaat başlayın. Yarısında tel katlayın. Onları birbirine yapışmasına çifti boyunca parmaklarınızı çalıştırın. Tel çifti tüm uzunluğu boyunca iyi bir temas var emin olun.
2. Çifti, iki ucu bir arada tutarak tekrar katlayın. Bir ucunda oluşan döngü bükülmüş olmadığından emin olun. Dört ipuçları hizalanır ve böylece olmayan ilmekledi ucunda dört tel kesin.
3. Bir sonraki adım için, değiştirilmiş bir timsah klibi, motorlu bir dönüm cihaz ve dönüm cihaz üzerinde bir yatay çubuk gerekir. Timsah klibi yapıştırma klibin tabanına bir plastik çubuk ile değiştirilir. Tel uçları maruz kalan yerlerde, değiştirilmiş timsah klibi ile birlikte dört tel kelepçe. Yatay çubuk üzerinde tellerin döngü asın. Motorlu aşamaya timsah klibi yerleştirin.
4. Yaklaşık üç dakika boyunca kablo demetine 40 karşı saat yönünde katlanmış takiben 80 saat bilge katlanmış uygulayın. Bu parametreler, kendi ihtiyaçlarınıza göre çeşitli olabilir.
5. Tetrode büküm tamamlandıktan sonra, orta-düşük akım kullanılarak, üç farklı açılardan (420 ° C veya 790 ° F) ısı tabancası ile ısıtarak teller birbirine kaynaştırmak. Her açı için yaklaşık 5 saniye boyunca 2 cm mesafeden teller, tel paket böler 1-2 cm başlamak ısı tabancası aşağı koşmak ve. Yüksek sıcaklıklarda izolasyon tamamen erimesini ve kısa devrelere neden olarak dikkatli kullanın.
6. Şimdi tellerin birbirine kaynaşmış, hafifçe tetrode gerilimi rahatlatmak için timsah klibi kaldırarak büküm aparatları tetrode kaldırmak ve timsah klibi yakın tetrode kesmek. Diğer ucunda eşit uzunlukta tel dört olmayan gümrüklü ipliklerini olduğu gibi döngü kesti.
7. Sonra, yumuşak uçlu bir cımbız ile telleri hafifçe bükerek üst kısmındaki saç tellerini ayırın.
8. Tetrode şimdi mikro sürücü diziye yükleme için hazırdır. 21 ila 25 daha fazla tetrodes olun ve tozsuz bir kutuya tetrode yükleme işlemi için zamanı gelene kadar saklayabilirsiniz.

2. Mikro sürücü diziye tetrodes ve toprak kablolarını yükleme

1. Devam etmek için, tam bir mikro-sürücü dizi gerekir. Henüz birini inşa varsa, 'Mikro-sürücü dizi kronik in vivo kayıt için: sürücü fabrikasyon' video bakın Tasarım planında, elektrot uçları mikro sürücü dizi temel altında uzatmak gibi mikro-sürücü taşıyıcı tüp poliimid tetrode bağlantı parçaları bir ucunda bağlı olacak ve sonuna kadar devam edecek.
2. Başlamadan önce, bir ucunda konektör kuruluna bağlı ve diğer ucunda bir panavise tarafından sıkıştırılmasını edilebilir bir sürücü tutucu oluşturmak. Bu örnekte, sürücü sahibinin, bir X-Acto bıçak sapı (Şekil 1c) bir ucunu yapıştırılmış bir değirmen-max konektörü.
3. Tetrode Holding ve yumuşak uçlu bir cımbız ile bir Stereoskop kullanarak tetrode ucu itmek mikro sürücüler bir taşıyıcı tüp poliimid. Bireysel elektrot telleri sürücü dizinin üstündeki konnektör kuruluna kadar tüpe tetrode itin. Teller, kıvırmayın veya viraj, oldukça dik çok bir açı, beyin girmek için tetrode neden olarak, ve tetrode bütünlüğünü zayıflatmak için değil dikkatli olun.
4. Yavaşça, yumuşak uçlu bir cımbız kullanarak elektrot arayüz kartı kendi deliklere dört tel diğer ucunu beslenirler. Yine, bükülme veya tel bükme kaçının. Dört tel, pense kısaltılmış bir alt çene bir çift altın iğneli deliklerin içine doğru itin. Pimleri deliğin içine itilir, tel yalıtım bandı ve elektrik bağlantısı oluşturmak.
5. Daha sonra başvurmak için, mikro-elektrot arayüz kartı sürücüleri ve pim konumu arasındaki haritalama takip edebilirsiniz.
6. 18 tetrodes toplam yükleme devam edin. Dizi kalan üç mikro diskler, referans elektrot evine kullanılır. Her bir referans elektrot Yapışmayan dört tel biter, sadece birini kullanan bir tetrode yapılır. , Referans elektrotlar eklemek yükleme prosedürü takip edin ama sadece bir dört elektrot konnektörü tümleşik ilgili referans elektrot pin eklemek için.
7. Multi-site kayıtları planlıyorsanız, bunu tetrodes vaktinden konektörü, kartın bağlantıları planlamak için yararlı olabilir. Bu deneyler sırasında yanlış tetrode ayarlama olasılığını en aza indirmek gerekir.
8. Tetrode yükleme tamamlandıktan sonra, iki zemin teller, bir hayvan için bir koruyucu koni olun. 6 'uzun yalıtımlı çelik tel (metin: 0.005' çapı) kesin ve telin her iki ucunda, metal cımbız kullanarak, 3 mm izolasyon kaldırmak. Sonra 4 kesmek'Uzun yalıtımlı çelik tel (metin: 0.005' çapı). Bir ucundan diğer ucunda 1 cm 3 mm yalıtım çıkarın.
9. Route 6 'topraklama kablosu, mikro-sürücü dizi tarafındaki delikten ve arayüz kartı doğru. Belirlenen yere delik altın iğne ile elektrot arayüz kartı maruz tel bağlayın. Bu tel hayvanın kafatası bağlanacaktır.
10. Önceden yüklenmiş topraklama kablosu Rota 4 'topraklama kablosu paralel. Belirlenen başka bir yere delik bir altın iğne kullanarak elektrot arayüz kartı için 3 mm elimden sonuna bağlayın. Bu tel, gürültü azaltmak için küçük bir Faraday kafesi olarak hareket edecek bir koruyucu koni, daha sonra bağlı olacaktır. Şimdi bağlantı telleri bitmiş ve tetrodes rafine devam edebilirsiniz.

3. Tetrodes uzunluğu ayarlama

1. Amacımız, bu süreçte, onlar hedef beyin yapısı derinliği daha biraz daha uzun, böylece tüm tetrodes kesmek için. Bizim örneğimizde, mikro diskler, 5-6 mm, birçok neokortikal alanlar ve yetişkin bir sıçan dorsal hipokampus ulaşmak için yeterli bir maksimum seyahat için tasarlanmıştır. Birincisi, düşük tetrodes maksimum maruz kalmayacak şekilde tüm mikro-sürücüler. Aynı zamanda bir çift keskin ince makas kullanarak istediğiniz son uzunluğu yaklaşık 5 mm daha uzun olan uzunlukları tetrodes kesti.
2. Son kesim için bir panavise tırtıklı makas bir çift hazırlayın. Sarkan diğer kolu çıkarken, hafif bir açıyla aşağı ve yukarı bakacak şekilde çentikler bir kolu Kelepçe.
3. Şimdi mikro-sürücüler kadar çevirerek tamamen kendi kılavuz kanül tüm tetrodes çekebilirsiniz.
4. Stereoskop kullanarak, tamamen kendi kanül bir tetrode dışarı uzanır. Kılavuz kanül istenen mesafe bir cetvel, pozisyon tırtıklı makas kullanma. Yavaşça ve nazikçe bir düz hareketi ile tetrode kesti. Bu tetrode kesim edildikten sonra, 3-4mm kadar mikro sürücü çekebilirsiniz. Tüm kesilmiş kadar her tetrode için bu işlemi tekrarlayın. Bu noktada altın kaplama için hazır.

4. Tetrodes Altın kaplama ve kalite kontrol

Nikrom tetrode tel kaplama altın uzun vadeli istikrarlı kayıtları için kritik öneme sahiptir. Korozyon ve geliştirir biyouyumluluk önler.

1. Dış modunda empedans ölçer ve mevcut jeneratör, ses çıkışı (Şekil 1d) DC kontrol modunda Kur. Her tetrode içinde kanalları altı olası çiftleri mevcut jeneratör iki yol açar dokunun ve çiftleri arasındaki şort varsa belirlemek için ses görüşlerinizden yararlanacağız. Kısa bir süre varsa, tırtıklı makas ve testi ile tekrar tetrode yeniden kesmek. Sorun devam ederse, tetrode atmak ve değiştirin.
2. Tüm tetrodes içinde herhangi bir şort var, bildiğim kadarıyla mümkün tetrodes uzanan, tüm mikro-sürücüler aşağı hareket ettirin.
3. Elektrot empedansı (Şekil 1e) kontrol etmek için donanım yapılandırması değiştirin. Şimdi tüm tetrodes uçları, altın kaplama standart çözüm banyo içine batırın. Altın banyo elektriksel empedansı metre olumlu kurşun bağlanır. Elektrot empedansı ilgili pin konnektörü tümleşik negatif empedans metre kurşun dokunarak kontrol edin.
4. Ölçü ve mikro sürücü dizi her tel empedansı kayıt. Normal değerler 1-3 MOhm aralığı.
5. Mevcut jeneratör, 1-3 uA arasındaki mevcut ayarlayın. Sonra, güvenli konektörü, kartın üzerindeki pin negatif empedans metre kurşun takın. Ekipman galvanik yapılandırma (Şekil 1f) içine yerleştirin. Empedans ölçer, hızlı modunu atlayacak, normal modda geçiş ve geri. Bypass modunda iken, cari tetrode ve altın çözümü üzerinden geçecek ve elektrot ucuna altın kaplama olacak. Kaplama her turdan sonra empedans öncesine göre daha az olmalıdır. Empedansı 1 Mohm altına düştüğü olmasaydı akım darbesi tekrarlayın. Kabul empedanslar bir muhafazakar aralığı 350 kOhm 250kOhm. Empedansı 200 kOhm altına düşerse, bu bir kısa devre gösterebilir.
6. Tekrarlanan darbeler sonra empedans yeterince bırak değilse, elektrot ucu tıkalı olabilir. Tetrode Re-cut, şort kontrol edin ve altın kaplama işlemi tekrarlayın. Yeniden kesme yardımcı olmazsa, tetrode değiştirin ve tekrar başlayın.
7. Tüm tetrodes kaplama sonra, etanol, kısaca tetrode ipuçları daldırma ve 3 ila 5 dakika süreyle kurumaya bırakın.
8. Havaya maruz tetrode ipuçları mevcut jeneratör kullanarak tetrodes içinde kısa devre test edin. Bir tetrode iki veya daha fazla elektrot arasındaki DC bağlantısı varsa, tetrode ve altın plaka tekrar tekrar kesilmiş.
9. Tüm tetrodes altın kaplama işlemi tamamlandıktan sonra, her tetrod arasındaki arayüz için orta kalınlıkta siyano-akrilat yapıştırıcı bir damla eklemeke ve onun boru poliimid. Bu, mikro-sürücü, tetrode güvenli ve tetrode uzunluğu koruyacaktır.
10. Son bir adım olarak, tüm vidaları çevirerek tüm tetrodes sürücüye taşıyın.

5. Koruyucu koni takma

Koruyucu koni amacı çevre mikro sürücüler ve maruz tetrode tel kalkan. Aynı zamanda bir deney sırasında kullanım için destek sağlar ve elektriksel gürültü azaltır. Biz bir 3-D baskılı plastik konisi (: sürücü imalat Referans Bölüm I) kullanın. Ancak, soda bükük bir parça gibi diğer malzemeler koni yapmak mümkündür.

1. Plastik koni ve iç veya dış yüzeyine bazı alüminyum folyo bant düzeltmek.
2. Sonra, koni ile küçük bir delik delme (çapı 1.5 mm) ve gevşek konisi içinde bir pul ve somun ile vida takın. Bu elektrik topraklama kablosu için bir geçit olarak görev yapacak. Biz 0-80 boyutu vida ve pul kombinasyonu kullanmanızı öneririz.
3. İlk olarak, insert ve kısmen koni iki üç 1-72 boyutu vidaları (3 / 16 inç uzunluğunda) açın. Sürücü dizi askıya üzerinde koni, sürücü takın. Her iki toprak kablolarını sürücü dizinin alt uzanan emin olun. 4 'topraklama kablosu açıkta kalan parçası birkaç kez 1-72 vida etrafında sarın ve sıkıca vidayı sıkın. Sürücü tabanı koni kalan iki koni vidaları sıkarak sabitleyin.
4. Son olarak, 1 cm kısa zemin tel elimden sonuna almak ve folyo bant ve yıkama arasında, vida çevresinde rüzgar. Vidayı sıkarak yere sabitleyin. Şimdi son olarak cerrahi implantasyon için hazır bir mikro-sürücü dizi var.

6. Temsilcisi sonuçları

1. Micro-sürücü dizi üretimi tamamlandı. Mikro-sürücü dizi, 18 tetrodes ve 3 referans kanalı ile yüklenir. Dayanıklılık için, koruyucu bir koni ve kap kaplı. Koruyucu koni ile bitmiş bir dizi mikro-drive ortalama 25g için 20g ağırlığındadır.
2. Bitmiş sürücü dizi standart cerrahi prosedür kullanılarak yerleştirilir. Gördüğünüz gibi, sürücü preamplifikatör çip ve veri toplama donanım ve yazılım için sinyal taşıyan tellerin bir paket eklenir.

Şekil 1: A) tetrode büküm yapılandırması şematik. Yatay çubuk otomatik tetrode büküm cihazı üzerinde tetrode Yapışmayan elektrot telleri askıya alır. B) Kurulum tetrode empedansı ölçümü ve elektrot kaplama. C) kısa devreleri kontrol ederken, devre farklıdır: siyah tel, konektörü, kartın üzerindeki başka bir elektrot kanal bağlı olduğu özel bir close-up (yakın çekim) bir dizi mikro-sürücü sahibinin aracı yaptı . Silindirik çubuğu X-Acto bıçak sapı. Konektörü 26-pin, çift sıralı, Mill-max konnektör. Kısa kontrol etmek için iki adet diş akrilik kullanarak birbirine yapıştırılır. D) Yapılandırma. Kanal X ve Kanal Y dört tetrode kanalı herhangi iki farklı kanal E) Yapılandırma elektrot empedansı ölçmek için. Akım kaynağı, 'kapalı'. Empedans ölçer 'açık' ve 'test' F) elektrot ipuçları altın kaplama için yapılandırma. Akım kaynağı 'açık', ses, 'açık', modu 'tek kutuplu', DC Testi 'açık', 2 mikroamper akım ayarlanır.

Discussion

Bu protokol, iki parçalı bir protokolün ikinci taksiti: "Mikro-drive bir dizi kronik in vivo kayıt." Mikro sürücü dizi ve tetrode kombinasyonu bir uyanık aynı anda birçok nöron kayıtları elde etmek için güçlü bir araçtır, hayvan hazırlık davranıyor. Umarım, biz kendi laboratuvar elektrofizyolojik kayıtlar başlamak ya da geliştirmek için ihtiyaç için tüm gerekli bilgileri vermiş.

Motorlu tetrode twister cihaz özel tasarlandı ve üretildi. Biz, benzer bir cihaz sipariş etmek için izin verecek bir satıcı ve parça numarası sağladı. Alternatif olarak, motorlu bir dönüm cihaz sadece bir timsah klibi bağlı bir manyetize karıştırma çubuğu ile motorlu Dönen bir çubuk mıknatıs birleştirerek ev inşa edilebilir; Bu yapılandırmada büyük olasılıkla dönmeler, dönme yönünü manuel iptali sayımı manuel gerektirir, ve manuel başlama / durdurma.

Bazı elektrot arayüz kartlarını elektrot tel bağlamak için pin-hole mekanizmaları yoktur. Bunun yerine, konnektör kurulu dışarı uzanır metal pimler bir arayüz kartı almış olabilir; gibi metal pimler genellikle standart elektronik bileşenler üzerinde bulunanlara benzer. Biz kısaca metal pimler tetrode kanalları bağlamak için bir metodoloji. Birincisi, her tetrode dört elektrot telleri ipuçları izolasyonu kaldırmak. Bu el bütan meşale kullanarak mümkün olduğunca kısa süreli bir alev gibi her elektrot ucu uygulanarak yapılır. Metal pim üzerinden kolayca uyacak şal küçültmek alın ve shrink wrap ısıtmalı edildikten sonra pin sıkıca sıkmak. Shrink wrap boru metal pin uzunlukta kesin. Shrink wrap gümüş boya ile doldurmak için kılcal eylemini kullanın. Shrink wrap içine bir elektrot teli maruz ucu takın. Shrink wrap elektrot teli pin ve shrink wrap duvar arasında olduğu gibi, metal pim üzerinde yavaşça kaydırın. Tetrode kalan üç elektrot kanallar için bu adımları yineleyin. Son olarak, bir yan-yan hareketi ile bir ısı tabancası, ısı dört iğneli (shrink wrap içinde elektrot telleri ile) shrink wrap kaplı. Bu noktada, tetrode ve konektörü kurulu arasında istikrarlı ve güvenilir bir bağlantı olmalıdır.

Çok az güç onlara zarar için gerekli olduğu gibi bu fabrikasyon boyunca bakım prosedürleri ile elektrot telleri ele. Tetrode ve mikro-sürücü dizi prosedür birçok adım ve her adımda yüksek kalitede veri elde etmek için diğerleri gibi çok önemlidir. Burada açıklanan protokol Laboratuvarımızda mevcut ekipman dikkate için iyi çalıştı. Kendi laboratuvar kaynakları farklı olabilir, bu nedenle, her adımda dikkatli bir şekilde düşünün ve optimum performans elde etmek için, kendi gereksinimleri ve kısıtlamaları karşılamak için protokol değiştirmek için tereddüt etmeyin.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.