Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.
Summary
Микроинъекция является устоявшейся и эффективным методом для введения чужеродных веществ в оплодотворенных эмбрионов данио. Здесь мы демонстрируем надежной техники микроинъекции для выполнения мРНК гиперэкспрессия и морфолино олигонуклеотидных гена нокдаун исследований в данио.
Abstract
Важным инструментом для исследования роли генов в процессе развития является способность выполнять гена нокдаун, гиперэкспрессия и misexpression исследований. В данио (<em> Danio rerio</em>), Микроинъекции РНК, ДНК, белки, антисмысловых олигонуклеотидов и других малых молекул в развивающемся эмбрионе предоставляет исследователям быстрого и надежного анализа для изучения функций генов<em> В естественных условиях</em>. В этом видео-статье, мы покажем, как готовить и microinject<em> В пробирке</em> Синтезированных EGFP мРНК и поступательного блокировки морфолино олиго против<em> PKD2</em>, Ген, связанный с аутосомно-доминантным поликистозом почек (ADPKD), в 1-клеточной стадии эмбрионов данио. Затем мы анализируем успехи мРНК и морфолино микроинъекций путем проверки выражения GFP и фенотип анализа. Широкое применение этого метода относятся создании трансгенных животных и зародышевой линии химеры, клеточной судьбы отображение и генной скрининга. Здесь мы опишем протокол для экспрессией EGFP и нокдаун<em> PKD2</em> По мРНК и морфолино олигонуклеотидных инъекции.
Protocol
Discussion
Микроинъекция в данио эмбрионов устоявшиеся и надежные методики изучения роли конкретного гена в развитии. Приложения включают гиперэкспрессия, misexpression и нокдаун анализы вашего интересующего гена, а также анализ эпистатических между несколькими генами. Микроинъекция в данио широко ?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH и PKD основу для ZS. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Йеле животных ресурсов Центра (YARC) и Уходу за животными и использование комитета (IACUC) руководящих принципов.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
References
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
