Summary
Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.
Abstract
Een essentieel instrument voor het onderzoek naar de rol van een gen tijdens de ontwikkeling is de mogelijkheid om gen knockdown, overexpressie en misexpression studies uit te voeren. In zebravis (
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van micropipetten, en micro-injectie kamer platen
- Fabriceren micropipetten door te verwarmen en te trekken borosilicaatglas capillaire buisjes (World precisie-instrumenten, Inc, 1B100-4) in een micropipet trekker apparaat (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97). Te slaan in een petrischaal op de top van kleine hoeveelheid klei of plakband.
- Giet 1,5% agarose (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) in 1x E3 medium platen gevormd met wigvormige troughs dat zal als een eenvoudige methode dienen voor het houden van de embryo's tijdens de injectie (zoals beschreven in 'de zebravis Book ") 1. Laat agar kamer platen stollen voor gebruik en bewaar bij 4 º C.
Deel 2: Voorbereiding van RNA
Een krachtige aanpak voor gen-functie studies is om microinject in-vitro getranscribeerde RNA afgedekt in de zebravis embryo's. Capped RNA gedraagt zich op dezelfde wijze als eukaryote mRNA's gevonden in vivo door de aanwezigheid van het GLB analoog. Zebravis onderzoekers regelmatig gebruik maken van deze methode om overexpressie of misexpress hun gen van interesse. In deze demonstratie zullen we microinject een EGFP-gelabeld transcript en gebruik wordt gemaakt van hele embryo GFP-expressie als een zichtbare uitlezing voor een succesvolle injectie.
- Voer een in-vitro CAP RNA-transcriptie reactie op je cijferlijst van belang zijn. In ons lab hebben we regelmatig plaats een cDNA van belang in een pCS2 + vector en het uitvoeren van een in vitro synthese reactie van grote hoeveelheden van de afgetopte RNA met behulp van de mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc, AM1340).
- Zuiveren de RNA-monster door het uitvoeren van het door de RNeasy Mini kit (Qiagen, Inc, 74.104) of door fenol: chloroform extractie en isopropanol neerslag.
- Zorgvuldig bepalen van de concentratie van het RNA-bereiding en bewaar bij -80 º C tot klaar voor gebruik.
- Op de dag van de injectie, licht dooi de RNA-monster, vortex en kort spin down.
- Bereid een werkende oplossing met steriel water en een uiteindelijke concentratie van 0,025 - 0.050% fenol rood (Sigma-Aldrich Co, P0290). Fenol rood fungeert als een zichtbare marker voor de injectie van de oplossing in het embryo. In dit artikel zullen we een werkende oplossing van 100 ng / ul EGFP mRNA voor te bereiden met 0,050% fenol rood.
- Blijf werken monster op ijs en terug te keren RNA voorraad tot -80 ° C.
- Ga verder met deel 4 zodra u gereed bent om dit voorbeeld te injecteren.
Deel 3: Voorbereiding van morfolino
Morfolino antisense oligonucleotiden worden op grote schaal gebruikt om de genexpressie te wijzigen door het blokkeren van de vertaling van een gerichte eiwit of door het wijzigen van pre-mRNA splicing 2,3. Morpholinos in de zebravis dienen als een krachtig reverse genetics instrument door iemand aan de functie van een gen. In dit artikel zullen we microinject een morfolino oligo gericht op de translatie-initiatie site van PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). Op basis van eerder vastgestelde werken, verwachten we dat de geïnjecteerde embryo's na te bootsen fenotypisch PKD2 mutant vissen 4.
- We routinematig volgorde 300 nmol van een morfolino oligo speciaal is ontworpen voor een gen van interesse van Gene Tools, LLC (Philomath, OR).
- Voeg 100 uL steriel water om een 3 mM voorraad-oplossing te maken. Aliquot de oplossing en bewaar bij -20 ° C tot aan gebruik.
- Op de dag van de injectie, warmte de morfolino-oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Onmiddellijk Snap koel op ijs en spin kort. Deze stap denatureert secundaire structuren in de oligo en zorgt ervoor dat de oplossing volledig is opgelost.
- Bereid een werkende oplossing door verdunning van de morfolino-oplossing in steriel water en een uiteindelijke concentratie van 0,025 - 0.050% fenol rood. In deze demonstratie zullen we de voorbereiding van een werkende oplossing van 0,50 mM PKD2 morfolino met 0,050% fenol rood.
- Blijven werken oplossing bij kamertemperatuur.
- Ga verder met deel 4 zodra u gereed bent om dit monster te injecteren .----
Deel 4: Het vullen van de micropipet met uw werkende oplossing
- Snijd de distale tip van een micropipet met een pincet of een chirurgische scheermes om een opening die net zichtbaar onder een dissectiemicroscoop (Nikon Instruments, Inc, SM2645) bij 50x vergroting te creëren.
- Plaats 2 uL van uw werkende oplossing als een druppel op een dekglaasje aan.
- Bevestig de achterkant van een micropipet om een 5 ml injectiespuit voorzien van buizen op een injectienaald en lichtjes onder water de distale tip van de micropipet in je druppel werkende oplossing. Zorg ervoor dat het topje van de micropipet te breken.
- Sifon de werkende oplossing door het distale uiteinde van de micropipet door aan de zuiger van de spuit.
Deel 5: Het kalibreren van de micropipet injectievolume
- Plaats een druppel van minerale olie (Amerikaanse Bioanalytisch, Inc, AB00921-00025) op een micrometer (Fisher, 12-561-SM1).
- Schakel de stroom en luchttoevoer naar de druk-gepulste micro apparaat injector (World Precision Instruments Inc, PV830).
- Bevestig de micropipet om de micropipet houder van de micro-injector apparaat. De micro-injector is druk geregeld en lozingen worden geactiveerd door het indrukken van het voetpedaal.
- Onder de dissectie microscoop, test de injectie volume door gebruik te maken van de micro-injector tot een daling van uw werkende oplossing op de micrometer olie plaats. Meet de diameter van de druppel als het zweeft als een bol op de top van de olie.
- Stel de duur en de druk van de injectie om zorgvuldig te kalibreren uw volume van de injectie. Deze stap helpt bij de reproduceerbaarheid van de micro-injectie experiment. In deze demonstratie worden alle micro-injecties worden gedaan met een druppel diameter van 0,15 mm (ongeveer 1,76 nL in volume).
- Zodra uw injectie volume is gekalibreerd, gebruik dan de "Hold" knop op de micro-injector voor opvullen en het lekken van de micropipet te voorkomen.
Deel 6: Het voorbereiden van bevruchte zebravis embryo's voor micro-injectie
- Zebravissen worden willekeurig paren in de eerste paar uur van iedere ochtend. Verzamel embryo's in het een-cellig stadium en plaats ze in 1x E3 medium.
- Met behulp van een 3 ml overdracht pipet (Becton Dickinson Laboratoriumbestek, 357.524), regelen de embryo's langs de wig-vormige dalen in de micro-injectie kamer platen.
- Verwijder het medium, zodat de embryo's ondiep onder water staan en niet overstroomd. Deze stap helpt bij het oplossen van de embryo's naar de bodem van de troggen als in de penetratie van de chorion door de micropipet.
Deel 7: micro-injectie door het chorion
- Manipuleren van de embryo's met de micropipet, zodat het cytoplasma van de een-cellig stadium embryo is zichtbaar onder de microscoop te ontleden. Zorg ervoor dat het topje van de micropipet te breken.
- Dringen de chorion en dan de dooier met de micropipet om te injecteren in de embryo. In deze demonstratie zullen we de eersten zijn microinjecting in de dooier direct onder de cel, en laat cytoplasmatische stroming en diffusie naar de werking oplossing te brengen in de cel. Deze stroom is zichtbaar door de fenolrood toegevoegd aan de werkende oplossing.
- Wij zullen directe injectie ook aantonen in de cel cytoplasma. Directe micro-injectie in de cel is meer robuust, maar tijdrovend als een goede embryo oriëntatie en micro-injectie techniek is vereist. Als het celmembraan is strenger dan de dooier membraan, is het vaak sneller om de micropipet binnenkomen via de dooier naar de cel cytoplasma te bereiken. Oriëntatie van de dier paal naar de bodem van de trog en het werken met vaste hand kan de steun in deze methode van de injectie.
- Na de micro-injectie, plaatst u de embryo's in een petrischaal met de E3 medium en incubeer ze op 28,5 ° C voor een normale ontwikkeling.
- In de komende uren en dagen van embryo-ontwikkeling, leven zij de embryo's voor uw fenotypen van belang.
Deel 8: Representatieve resultaten
EGFP mRNA overexpressie: Om te controleren voor het succes van de micro-injectie, zullen we toezicht houden op de expressie van GFP in de zich ontwikkelende embryo's vanaf schild stadium (~ 6 HPF) door in vivo hele embryo fluorescentie microscopie (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expressie van het construct is het meest sterk tijdens de vroege gebeurtenissen van de embryonale ontwikkeling en zal vaak dalen tijdens de ontwikkeling als de geïnjecteerde capped RNA wordt geleidelijk afgebroken en is afhankelijk van de stabiliteit van de expressie gebrachte eiwit.
PKD2 translationele-blokkerende morfolino: Op basis van eerder gepubliceerde resultaten, verwachten wij dat het PKD2 morphants aan de dorsale lichaam as kromming zoals gevonden in PKD2 mutant zebravis en aanwezig nieren cysten op ongeveer 2 na te bootsen - 3 DPF 4.
Figuur 1: Representatieve resultaten van micro-injectie van EGFP mRNA-en PKD2 augustus morfolino. (A) TAB-embryo's werden gemicroinjecteerd op de een-cellig stadium met 0,17 ng van EGFP mRNA en gevisualiseerd op een DPF voor in vivo GFP expressie. (B, c) TAB embryo's werden gemicroinjecteerd op de een-cellig stadium met ~ 1,7 nl van een PKD2 translationeel blokkeren morfolino bij 0,50 mm en scoorde voor het dorsale lichaam kromming op 4 DPF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Micro-injectie in de zebravis embryo's is een gevestigde en robuuste techniek voor het verkennen van de rol van een bepaald gen in ontwikkeling. Toepassingen zijn onder andere overexpressie, misexpression en knockdown testen van uw gen van belang evenals epistatisch analyse tussen meerdere genen. Micro-injectie in de zebravis is op grote schaal gebruikt voor het genereren van transgene dieren, en in kaart brengen lot van de cel in het begin van blastula embryo's 5,6,7,8,9. Daarnaast is de toepassing van deze techniek dient als een belangrijke stap in het genereren van kiem-line hersenschimmen door celtransplantatie methoden 10.
Een alternatieve methode voor het verkennen van een gen dat de 'gain-of-function' fenotype is om microinject constitutief actieve vormen van dat gen. Daarnaast kan een gen van de pseudo-verlies-van-functie 'fenotype worden onderzocht door micro-injectie van de dominante negatieve vormen van dat gen. Micro-injectie in de zebravis embryo's kan ook DNA en kleine moleculen 11,12.
Een kritische stap in deze micro-injectie techniek is de kwaliteit van de micropipet naald. Wij maken onze micropipet van capillaire buisjes gevormd door een pipet trekker-apparaat. Het is essentieel dat de pipet trekker goed is gekalibreerd om een optimaal naald vorm en grootte opbrengst. Micropipetten die te lang en smal vaak niet stijfheid, gemakkelijk breken en strijd om het chorion en de dooier dringen. Kortom micropipetten zijn vaak gevoeliger voor beschadiging van het embryo tijdens de micro-injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NIH en PKD stichting ZS. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Yale Animal Resources Center (YARC) en institutionele Dierverzorging en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
||
| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
