Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo's.
Summary
Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.
Abstract
Een essentieel instrument voor het onderzoek naar de rol van een gen tijdens de ontwikkeling is de mogelijkheid om gen knockdown, overexpressie en misexpression studies uit te voeren. In zebravis (<em> Danio rerio</em>), Micro-injectie van RNA, DNA, eiwitten, antisense oligonucleotiden en andere kleine moleculen in de zich ontwikkelende embryo biedt onderzoekers een snelle en robuuste test voor het verkennen van genfunctie<em> In vivo</em>. In deze video-artikel zullen we zien hoe voor te bereiden en microinject<em> In vitro</em> Gesynthetiseerd EGFP mRNA en een translatie-blokkerende morfolino oligo tegen<em> PKD2</em>, Een gen geassocieerd met autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD), in een-cellig stadium zebravis embryo's. Wij zullen Vervolgens analyseren van het succes van het mRNA en morfolino-micro-injecties door te controleren of GFP expressie en fenotype-analyse. Brede toepassingen van deze techniek zijn onder het genereren van transgene dieren en kiem-lijn hersenschimmen, cel-lot in kaart brengen en gen-screening. Hierin beschrijven we een protocol voor overexpressie van EGFP en de knock-down van<em> PKD2</em> Door mRNA en morfolino oligonucleotide injectie.
Protocol
Discussion
Micro-injectie in de zebravis embryo's is een gevestigde en robuuste techniek voor het verkennen van de rol van een bepaald gen in ontwikkeling. Toepassingen zijn onder andere overexpressie, misexpression en knockdown testen van uw gen van belang evenals epistatisch analyse tussen meerdere genen. Micro-injectie in de zebravis is op grote schaal gebruikt voor het genereren van transgene dieren, en in kaart brengen lot van de cel in het begin van blastula embryo's 5,6,7,8,9. Daarnaast is de toepassing v…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH en PKD stichting ZS. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Yale Animal Resources Center (YARC) en institutionele Dierverzorging en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
References
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
