Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.
Abstract
أداة أساسية للتحقيق في دور الجينات خلال التنمية هو القدرة على تنفيذ ضربة قاضية الجينات ، overexpression والدراسات misexpression. في الزرد (<em> دانيو rerio</em>) ، microinjection من الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي والبروتينات والعقاقير [أليغنوكليوتيد] والجزيئات الصغيرة الأخرى في الجنين النامية تقدم الباحثون فحص سريعة وقوية لاستكشاف وظائف الجينات<em> في الجسم الحي</em>. في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، وسوف نقوم شرح كيفية إعداد وmicroinject<em> في المختبر</em> توليفها EGFP مرنا ومتعدية للحظر جزئية ضد morpholino<em> pkd2</em> ، وهو الجين المرتبط راثي جسمي أمراض الكلى المتعدد الكيسات (ADPKD) ، إلى خلايا الأجنة 1 الزرد المرحلة. وسوف نقوم بتحليل ثم نجاح مرنا وmicroinjections morpholino من خلال التحقق من التعبير GFP وتحليل النمط الظاهري. تطبيقات واسعة من هذه التقنية تشمل الحيوانات المعدلة وراثيا وتوليد الوهم الجرثومية الخط ، ورسم خرائط مصير الخلايا وفحص الجينات. هنا نحن تصف بروتوكول للoverexpression من EGFP وضربة قاضية ل<em> pkd2</em> من جانب ومرنا morpholino حقن قليل النوكليوتيد.
Protocol
الجزء 1 : إعداد micropipettes وألواح غرفة microinjection افتعال micropipettes عن طريق التسخين وسحب الأنابيب الزجاجية البورسليكات الشعرية (البنك الآلات الدقيقة ، وشركة ، 1B100 – 4) في جهاز مجتذب micropipette (سوتر الآلات ، وشركة يلهب / براون P – 97). مخز…
Discussion
Microinjection في الأجنة الزرد هي تقنية راسخة وقوية لاستكشاف دور جين خاص في مجال التنمية. وتشمل التطبيقات overexpression ، misexpression ، وضربة قاضية لفحوصات الجينات اهتمامك ، فضلا عن تحليل روكبي بين جينات متعددة. وقد Microinjection في الزرد المستخدمة على نطاق واسع لتوليد حيوانات معدلة وراثي?…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة PKD لZS. وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لمركز يال الثروة الحيوانية (YARC) والمؤسسية رعاية الحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1x E3 Medium
Reagent
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).