Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.
Summary
Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.
Abstract
כלי הכרחי לחקירת תפקידו של הגן במהלך הפיתוח היא היכולת לבצע מציאה גן, overexpression, ומחקרים misexpression. בשנת דג הזברה (<em> Danio rerio</em>), Microinjection של רנ"א, דנ"א, חלבונים, מולקולות אנטיסנס ומולקולות קטנות אחרות לתוך העובר המתפתח מספק לחוקרים assay מהירה וחזקה לבחינת תפקוד הגן<em> In vivo</em>. במאמר-video זה, אנו מדגימים כיצד להכין microinject<em> במבחנה</em> מסונתז EGFP mRNA ו-translational חסימת morpholino אוליגו נגד<em> Pkd2</em>, גן הקשור למחלת כליה פוליציסטית אוטוזומלית דומיננטית (ADPKD), אל 1 תאים בשלב עוברי דג הזברה. נמשיך לנתח את ההצלחה של ה-mRNA ו microinjections morpholino ידי אימות ביטוי של GFP וניתוח פנוטיפ. יישומים רחב של טכניקה זו כוללות יצירת חיות טרנסגניות ונבט קו מפלצות, התא גורל מיפוי וסינון גן. בזאת אנו מתארים פרוטוקול עבור overexpression של EGFP ו מציאה של<em> Pkd2</em> על ידי ה-mRNA הזרקת morpholino oligonucleotide.
Protocol
Discussion
Microinjection לתוך עוברי דג הזברה היא טכניקה מבוססת היטב וחזק לחקור את תפקידו של גן מסוים בהתפתחות. היישומים כוללים overexpression, misexpression, מבחני מציאה של הגן העניין שלך, כמו גם ניתוח epistatic בין גנים רבים. Microinjection של דג הזברה כבר בשימוש נרחב עבור יצירת חיות טרנסגניות, מיפוי גורל תא ?…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH ו PKD יסוד ZS. כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי ייל מרכז משאבים בעלי חיים (YARC) ו Animal Care מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) הנחיות.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
References
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
