Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

Summary

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Abstract

כלי הכרחי לחקירת תפקידו של הגן במהלך הפיתוח היא היכולת לבצע מציאה גן, overexpression, ומחקרים misexpression. בשנת דג הזברה (

Protocol

חלק 1: הכנת micropipettes, קאמרית צלחות microinjection

1. לפברק micropipettes ידי חימום ומושכים צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי (World Precision מכשירים, Inc, 1B100-4) במכשיר חולץ micropipette (סאטר מכשירים בע"מ, Flaming / בראון P-97). חנות בצלחת פטרי על גבי כמות קטנה של חומר או דבק.
2. יוצקים agarose 1.5% (אמריקאי Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) ב 1x צלחות בינוני E3 יצוק עם בצורת טריז שקתות שישמש שיטה קלה לקיום עוברים במהלך הזריקה (כפי שמתואר בספר "דג הזברה") ^1. תנו קאמרית צלחות אגר לחזק לפני השימוש ולאחסן ב 4 º C.

חלק 2: עריכת RNA

גישה אחת חזקה ללימודי תפקוד הגן היא microinject ב-RNA במבחנה כתרים עיבד עוברי דג הזברה. RNA כתרים מתנהג בדומה mRNAs אוקריוטים מצאו in vivo בשל נוכחותם של אנלוגי CAP. החוקרים דג הזברה שגרתי לנצל בשיטה זו כדי overexpress או misexpress הגן העניין שלהם. בהפגנה זו, אנו microinject תמליל EGFP-tagged ולהשתמש לחיות כולו עובר GFP ביטוי כמו readout גלוי עבור זריקה מוצלחת.

1. בצע בתגובה במבחנה תעתיק הרנ"א CAP על תמליל העניין שלך. במעבדה שלנו, אנחנו באופן קבוע להוסיף cDNA עניין לתוך וקטור pCS2 + ולבצע בתגובה סינתזה במבחנה של כמויות גדולות של RNA כתרים באמצעות mMachine mMessage SP6 Kit (Ambion, Inc, AM1340).
2. לטהר את דגימת רנ"א ידי הפעלת אותו באמצעות ערכת מיני RNeasy (Qiagen, Inc, 74104) או על ידי פנול: מיצוי כלורופורם משקעים isopropanol.
3. בזהירות לקבוע את הריכוז של הכנת RNA ולאחסן ב -80 º C עד מוכן לשימוש.
4. ביום של הזריקה, ההפשרה מערבולת, RNA מדגם קלות ספין למטה בקצרה.
5. הכן פתרון לעבוד עם מים סטריליים וריכוז הסופי של 0.025 - 0.050% פנול אדום (סיגמא אולדריץ ושות', P0290). פנול אדום משמש כסמן גלוי עבור הזרקה של הפתרון לתוך העובר. במאמר זה, נכין פתרון העבודה של ה-mRNA ng / UL 100 EGFP עם פנול אדום 0.050%.
6. שמור מדגם עובדים על קרח מניות RNA לחזור -80 ° C.
7. המשך חלק 4 כאשר מוכן להזרים מדגם זה.

חלק 3: הכנת morpholino

Morpholino מולקולות אנטיסנס הן בשימוש נרחב לשנות ביטוי גנים על ידי חסימת תרגום של חלבון ממוקד או על ידי שינוי טרום mRNA splicing ^2,3. Morpholinos של דג הזברה משמשים כלי רב עוצמה גנטיקה הפוכה על ידי דריסה תפקוד הגן. במאמר זה, אנו microinject אוליגו morpholino ממוקדות לאתר החניכה translational של pkd2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 "). בהתבסס על העבודה שהוקמו קודם לכן, אנו מצפים העוברים מוזרק אל phenotypically לחקות pkd2 ⁴ דגים מוטנטים.

1. אנחנו באופן שגרתי כדי 300 nmol של אוליגו morpholino שתוכננו במיוחד עבור הגן של עניין מתוך כלים ג'ין, LLC (Philomath, OR).
2. מוסיפים מים סטריליים 100 UL לעשות 3 מניות פתרון מ"מ. הפתרון Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לשימוש.
3. ביום של הזריקה, חום הפתרון morpholino על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הצמד מגניב על קרח מיד ספין בקצרה. צעד זה denatures כל המבנים משני אוליגו ומבטיח כי הפתרון הוא solubilized לחלוטין.
4. הכן פתרון עובד על ידי דילול פתרון morpholino במים סטריליים ריכוז סופי של 0.025 - 0.050% פנול אדום. בהפגנה זו, נהיה הכנת פתרון עבודה של 0.50 mM pkd2 morpholino עם פנול אדום 0.050%.
5. להמשיך לעבוד פתרון בטמפרטורת החדר.
6. המשך חלק 4 כאשר מוכן להזרים מדגם זה .----

חלק 4: מילוי micropipette עם פתרון העבודה שלך

1. חותכים את קצה דיסטלי של micropipette עם מלקחיים או ניתוח בסכין גילוח כדי ליצור הפתיחה כי הוא גלוי רק תחת מיקרוסקופ לנתח (ניקון מכשירים, Inc, SM2645) בהגדלה של 50X.
2. מקום 2 UL של פתרון העבודה שלך כמו ירידה על coverslip.
3. צרף את החלק האחורי של micropipette כדי מזרק 5 מ"ל מצויד בצינור על מחט המזרק ואת מעט להטביע את קצה דיסטלי של micropipette לתוך ירידה של הפתרון שלך עובד. תשמרי על עצמך לא לשבור את קצה micropipette.
4. לשאוב את הפתרון עובד עד סוף דיסטלי של micropipette על ידי משיכת על הבוכנה של המזרק.

חלק 5: כיול נפח הזרקה micropipette

1. מקום טיפה של שמן מינרלי (American Bioanalytical, Inc, AB00921-00025) בשקופית מיקרומטר (Fiשר, 12-561-SM1).
2. הפעל את הכוח ואת אספקת אוויר בלחץ פעמו מיקרו מנגנון ההזרקה (World Precision מכשירים בע"מ, PV830).
3. צרף את micropipette לבעל micropipette המנגנון מיקרו ההזרקה. מזרק מיקרו הוא הלחץ מוסדר הפרשות מופעלים על ידי לחיצה על דוושת רגל.
4. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, לבדוק את עוצמת הזריקה באמצעות מזרק מיקרו למקום ירידה של פתרון העבודה שלך על הנפט מיקרומטר. מדוד את הקוטר של ירידה כפי שהוא מרחף כמו כדור על גבי השמן.
5. התאם את משך הלחץ של זריקה כדי לכייל את עוצמת הקול בזהירות של זריקה. צעד זה מסייע שחזור הניסוי microinjection. בהפגנה זו, microinjections כל ייעשה בקוטר ירידה של 0.15 מ"מ (כ 1.76 NL בנפח).
6. ברגע נפח הזרקה שלך כבר מכויל, השתמש כפתור "החזק" על מיקרו ההזרקה כדי למנוע דליפה של למלא את משבצות ו micropipette.

חלק 6: הכנת עוברי דג הזברה מופרית עבור microinjection

1. דג הזברה רצון להזדווג באופן אקראי בשעות הראשונות של בוקר. איסוף עוברים בשלב 1-התא למקם אותם בינוני 1x E3.
2. שימוש pipet 3 מ"ל ההעברה (בקטון דיקינסון labware, 357,524), לסדר את העוברים לאורך בצורת טריז שקתות של צלחות קאמרית microinjection.
3. הסר את המדיום, כך עוברים הם שקועים שטחית ולא מוצף. צעד זה מסייע ליישוב עוברים לחלק התחתון של שקתות כמו גם חדירה של סיסית על ידי micropipette.

חלק 7: Microinjection דרך סיסית

1. לתפעל את העוברים עם micropipette כך הציטופלסמה של העובר 1-תא הבמה גלוי מתחת למיקרוסקופ לנתח. תשמרי על עצמך לא לשבור את קצה micropipette.
2. לחדור סיסית ולאחר מכן את החלמון עם micropipette כדי להזריק לתוך העובר. בהפגנה זו, נוכל להיות הראשון microinjecting בחלמון ישירות מתחת לתא, ולאפשר זרימת דיפוזיה cytoplasmic ולהביא את הפתרון עובד לתוך התא. תזרים זה גלוי עקב האדום פנול הוסיף הפתרון עובד.
3. אנו גם להפגין הזרקה ישירה לתוך הציטופלסמה של התא. Microinjection ישיר לתוך התא הוא חזק יותר אבל זמן רב כמו אוריינטציה העובר תקין טכניקה microinjection נדרשת. כאשר קרום התא הוא קפדני יותר קרום החלמון, היא לעתים קרובות יותר מהר להיכנס micropipette דרך החלמון להגיע אל הציטופלסמה התא. המכוונת את הקוטב חיה לעבר החלק התחתון של השוקת ועבודה עם ידיים יציבות עשוי לסייע שיטה זו של זריקה.
4. לאחר microinjection, המקום עוברים לתוך צלחת פטרי עם המדיום E3 ו דגירה אותם 28.5 ° C להתפתחות נורמלית.
5. במשך כמה שעות, ימים של התפתחות העובר, להתבונן בעוברים פנוטיפים העניין שלך.

חלק 8: תוצאות נציג

EGFP overexpression mRNA: כדי לוודא את הצלחת microinjection, אנו תפקח את הביטוי של ה-GFP של עוברי בפיתוח תחילת בשלב מגן (~ hpf 6) על ידי במיקרוסקופ כולו עובר vivo פלואורסצנטי (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). הביטוי של הקמת חזקה ביותר במהלך האירועים המוקדמים של ההתפתחות העוברית לעיתים קרובות להפחית במהלך הפיתוח כמו רנ"א כתרים מוזרק מתפרק בהדרגה תלוי ביציבות של החלבון לידי ביטוי.

pkd2 translational חוסמות morpholino: בהתבסס על התוצאות שפורסמו בעבר, אנו מצפים pkd2 morphants לחקות את הגוף הגבי ציר העקמומיות כפי שנמצאו על כ 2 ב דג הזברה pkd2 מוטציה לבין ציסטות בכליות ההווה - 3 DPF ^4.

איור 1: תוצאות נציגת microinjection של mRNA EGFP ו pkd2 אוגוסט morpholino. (א) היו עוברים TAB microinjected בשלב 1 תאים עם 0.17 ננוגרם של mRNA EGFP ו דמיינו ב DPF 1 עבור הביטוי GFP vivo. (ב, ג) היו עוברים TAB microinjected בשלב 1 תאים עם ~ 1.7 nl של pkd2 morpholino חסימת translational ב mM 0.50 ו הבקיע עבור עקמומיות הגוף הגבי ב DPF 4.

Discussion

Microinjection לתוך עוברי דג הזברה היא טכניקה מבוססת היטב וחזק לחקור את תפקידו של גן מסוים בהתפתחות. היישומים כוללים overexpression, misexpression, מבחני מציאה של הגן העניין שלך, כמו גם ניתוח epistatic בין גנים רבים. Microinjection של דג הזברה כבר בשימוש נרחב עבור יצירת חיות טרנסגניות, מיפוי גורל תא עוברי מוקדם blastula ^5,6,7,8,9. בנוסף, היישום של טכניקה זו משמשת צעד מפתח ביצירת נבט קו מפלצות על ידי השתלת שיטות תא ^10.

אחת שיטה חלופית לחקר הפנוטיפ של הגן "להרוויח-of-פונקציה" היא microinject צורות פעיל constitutively של הגן. בנוסף, "הפסד של פונקציית" פסאודו של גן פנוטיפ עשוי להיחקר על ידי microinjection של צורות שלילי דומיננטי של גן זה. Microinjection לתוך עוברי דג הזברה עשוי לכלול גם DNA ומולקולות קטנות ^11,12.

שלב קריטי טכניקה זו microinjection הוא איכות המחט micropipette. אנחנו עושים micropipette שלנו צינורות נימי מעוצבת על ידי מכשיר חולץ פיפטה. זה חיוני כי חולץ פיפטה הוא מכויל כראוי להניב בצורת מחט גודל אופטימלי. Micropipettes כי הם ארוכים מדי, צר לעתים קרובות חוסר קשיחות, לשבור בקלות מאבק לחדור סיסית וחלמון. Micropipettes קצר הם לעתים קרובות נוטים יותר לפגוע בעובר במהלך microinjection.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x E3 Medium	Reagent			5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue
All other materials are listed in the protocol.