Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.
Abstract
Una herramienta esencial para investigar el papel de un gen durante el desarrollo es la capacidad de realizar caída del gen, la sobreexpresión y estudios misexpression. En el pez cebra (<em> Danio rerio</em>), La microinyección de ARN, el ADN, las proteínas, los oligonucleótidos antisentido y otras moléculas pequeñas en el embrión en desarrollo ofrece a los investigadores un ensayo rápido y robusto para explorar la función de genes<em> In vivo</em>. En este video-artículo, vamos a demostrar cómo preparar y microinject<em> In vitro</em> Sintetizado EGFP ARNm y un oligo-traslacional bloqueo contra morfolino<em> PKD2</em>, Un gen asociado con la enfermedad de herencia autosómica dominante del riñón poliquístico (PQRAD), en una de las células de embriones de pez cebra etapa. A continuación, se analizará el éxito de los ARNm y microinyecciones morfolino mediante la verificación de buenas prácticas agrarias expresión y análisis de fenotipo. Amplia gama de aplicaciones de esta técnica incluyen la generación de animales transgénicos y las quimeras de línea germinal, la cartografía de la célula-destino y la detección de genes. En este documento se describe un protocolo para la sobreexpresión de EGFP y caída de<em> PKD2</em> Por ARNm y la inyección de morfolino oligonucleótidos.
Protocol
Parte 1: Preparación de pipetas y placas de microinyección de cámara Fabricar micropipetas de calefacción y tirar los tubos capilares de vidrio de borosilicato (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) en un dispositivo extractor de micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Almacenar en una placa de Petri en la parte superior de la pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva. Vierta el 1,5% de agarosa (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) en placas de medio 1x E3 m…
Discussion
Microinyección en embriones de pez cebra es una técnica bien establecida y robusta para explorar el papel de un gen en particular en el desarrollo. Las aplicaciones incluyen la sobre-expresión, misexpression, y los ensayos de caída de su gen de interés, así como el análisis de epistasis entre múltiples genes. Microinyección en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para la generación de animales transgénicos y la asignación de destino de las células de los embriones tempranos de blástula 5,6,7,8,9…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el NIH y la fundación PKD de ZS. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con Yale Centro de Recursos Animales (YARC) y Atención Institucional para las directrices del Comité (IACUC).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1x E3 Medium
Reagent
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).