Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.
Abstract
Ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung der Rolle eines Gens während der Entwicklung ist die Fähigkeit, Gen Knockdown, Überexpression und misexpression Studien durchzuführen. In Zebrafisch (<em> Danio rerio</em>), Bietet die Mikroinjektion von RNA, DNA, Proteine, Antisense-Oligonukleotide und andere kleine Moleküle in den sich entwickelnden Embryo Forscher eine schnelle und robuste Assay für die Erkundung der Genfunktion<em> In vivo</em>. In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie die Vorbereitung und microinject<em> In-vitro-</em> Synthetisiert EGFP mRNA und eine translatorische-blocking Morpholino Oligo gegen<em> PKD2</em>, Ein Gen mit autosomal dominante polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD), in 1-Zell-Stadium Zebrafischembryonen verbunden. Wir werden dann analysiert den Erfolg der mRNA und Morpholino microinjections durch Überprüfung der GFP-Expression und Phänotyp-Analyse. Broad Anwendungen dieser Technik gehören Erzeugung transgener Tiere und Keimbahn-Chimären, Zell-Schicksal-Mapping und Gen-Screening. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Überexpression von EGFP und Knockdown von<em> PKD2</em> Durch mRNA und Morpholino Oligonukleotid Injektion.
Protocol
Teil 1: Herstellung von Mikropipetten und die Mikroinjektion Kammerplatten Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) in einer Mikropipette Abziehvorrichtung (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Shop in einer Petrischale auf der kleinen Menge von Ton oder Klebeband. Gießen Sie 1,5% Agarose (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) in 1x E3 Medium-Platten mit keilförmigen Rinnen, die als eine einfache Metho…
Discussion
Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen ist eine gut etablierte und robuste Technik für die Erkundung der Rolle eines bestimmten Gens in der Entwicklung. Zu den Anwendungen gehören Überexpression misexpression und Knockdown Assays Ihrer Gen von Interesse als auch epistatisch Analyse zwischen mehreren Genen. Mikroinjektion in Zebrafisch wurde weithin für die Erzeugung transgener Tiere und Mapping-Zell-Schicksal in frühen Blastula Embryonen 5,6,7,8,9 verwendet. Darüber hinaus dient die Anwendung dieser Tec…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH und PKD Stiftung ZS unterstützt. Alle Tierexperimente wurden nach Yale Tiere Resources Center (YARC) und Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1x E3 Medium
Reagent
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).