Zebrafish भ्रूण में mRNA और morpholino antisense oligonucleotides Microinjection.

Summary

Microinjection निषेचित zebrafish भ्रूण में विदेशी तत्वों को शुरू करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और प्रभावी तरीका है. यहाँ, हम mRNA overexpression प्रदर्शन के लिए एक मजबूत microinjection तकनीक, और morpholino zebrafish में oligonucleotide जीन पछाड़ना अध्ययन प्रदर्शित करता है.

Abstract

विकास के दौरान एक जीन की भूमिका की जांच के लिए एक अनिवार्य उपकरण जीन पछाड़ना, overexpression, और misexpression अध्ययन करने की क्षमता है. (Zebrafish में

Protocol

भाग 1: micropipettes की तैयारी, और microinjection चैम्बर प्लेटें

1. हीटिंग और एक micropipette खींचने डिवाइस में borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (विश्व प्रेसिजन उपकरण इंक, 1B100 4) खींच (Sutter उपकरण इंक, ज्वलंत / P-97 ब्राउन) द्वारा micropipettes बनाना. मिट्टी या चिपकने वाला टेप की एक छोटी राशि के शीर्ष पर एक पेट्री डिश में स्टोर.
2. 1x E3 मध्यम पच्चर के आकार troughs है कि एक आसान तरीका के रूप में इंजेक्शन के दौरान भ्रूण धारण करने के लिए सेवा (के रूप में 'Zebrafish "बुक में वर्णित) के साथ ढलना प्लेटें में 1.5% agarose (अमेरिकी Bioanlytical , इंक, AB00972 - 00,500) डालो ^1. अगर चैम्बर प्लेटें और 4 º सी. में उपयोग की दुकान से पहले जमना

भाग 2: शाही सेना की तैयारी

एक जीन समारोह के अध्ययन के लिए शक्तिशाली दृष्टिकोण करने के लिए इन विट्रो zebrafish भ्रूण में लिखित छाया शाही सेना में microinject है. छाया आरएनए यूकेरियोटिक कैप अनुरूप की उपस्थिति की वजह से vivo में पाया mRNAs के लिए इसी तरह व्यवहार करता है. Zebrafish शोधकर्ताओं ने नियमित रूप से इस पद्धति का उपयोग करने के लिए overexpress या ब्याज के अपने जीन misexpress. इस प्रदर्शन में, हम एक प्रतिलेख EGFP टैग microinject और एक सफल इंजेक्शन के लिए एक दृश्य readout के रूप में रहते हैं पूरे भ्रूण GFP अभिव्यक्ति का उपयोग करें.

1. इन विट्रो कैप आरएनए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में ब्याज की अपने प्रतिलेख पर एक प्रदर्शन करना. हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से एक pCS2 + वेक्टर में ब्याज की एक सीडीएनए डालने और इन विट्रो छाया mMessage mMachine SP6 किट (Ambion, इंक, AM1340) का उपयोग शाही सेना की बड़ी मात्रा में के संश्लेषण प्रतिक्रिया में एक प्रदर्शन.
2. यह RNeasy मिनी किट (Qiagen, इंक, 74,104) के माध्यम से चलाकर या phenol के द्वारा शाही सेना नमूना शुद्ध: क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण और isopropanol वर्षण.
3. ध्यान से -80 º सी में उपयोग के लिए तैयार है जब तक शाही सेना की तैयारी और दुकान की एकाग्रता का निर्धारण.
4. इंजेक्शन के दिन पर, शाही सेना नमूना भंवर, हल्के ढंग से पिघलना और नीचे संक्षेप में स्पिन.
5. 0.050% phenol लाल (सिग्मा Aldrich कं, P0290) - बाँझ पानी और 0.025 के अंतिम एकाग्रता के साथ एक काम समाधान तैयार है. Phenol लाल भ्रूण में समाधान के इंजेक्शन के लिए एक दृश्य मार्कर के रूप में कार्य करता है. इस अनुच्छेद में, हम 0.050% phenol लाल के साथ 100 एनजी / उल EGFP mRNA का एक काम समाधान तैयार करेंगे.
6. बर्फ और बदले आरएनए शेयर पर -80 डिग्री सेल्सियस कार्यशील नमूना रखें
7. भाग 4 के लिए आगे बढ़ें जब इस नमूने इंजेक्षन करने के लिए तैयार है.

भाग 3: morpholino की तैयारी

Morpholino antisense oligonucleotides व्यापक रूप से एक लक्षित प्रोटीन का अनुवाद अवरुद्ध करके या पूर्व mRNA splicing ^2,3 संशोधित करके जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जाता है. Zebrafish में Morpholinos नीचे जीन समारोह दस्तक द्वारा एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण के रूप में सेवा करते हैं. इस अनुच्छेद में, हम एक morpholino pkd2 के translational दीक्षा साइट (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 ') के लिए लक्षित oligo microinject जाएगा . पहले से स्थापित काम के आधार पर, हम इंजेक्शन भ्रूण phenotypically pkd2 उत्परिवर्ती ^मछली 4 नकल करने की उम्मीद है .

1. हम नियमित रूप से एक morpholino oligo के 300 nmol जीन उपकरण से ब्याज की एक जीन, LLC (Philomath, या) के लिए विशेष रूप से डिजाइन आदेश.
2. 100 उल बाँझ पानी जोड़ें करने के लिए एक 3 मिमी शेयर समाधान बनाने के लिए. विभाज्य समाधान और -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग के लिए तैयार है जब तक दुकान.
3. इंजेक्शन के दिन, 65 morpholino समाधान गर्मी ° 5 मिनट के लिए सी. बर्फ पर तुरंत शांत स्नैप और संक्षेप में स्पिन. यह कदम oligo में किसी भी माध्यमिक संरचनाओं denatures है और यह सुनिश्चित करता है कि समाधान पूरी तरह से solubilized है है.
4. 0.050% phenol के लाल - बाँझ पानी और 0.025 के अंतिम एकाग्रता में morpholino समाधान गिराए द्वारा एक काम समाधान तैयार करें. इस प्रदर्शन में, हम 0.050% phenol लाल के साथ .50 मिमी pkd2 morpholino के एक काम समाधान की तैयारी करेंगे .
5. कमरे के तापमान पर समाधान काम रखो.
6. भाग 4 के लिए आगे बढ़ें जब इस नमूने इंजेक्षन करने के लिए तैयार .----

भाग 4: अपने काम के समाधान के साथ micropipette भरना

1. संदंश के साथ एक micropipette के बाहर का टिप या एक शल्य चिकित्सा के लिए है कि सिर्फ 50X आवर्धन पर एक विदारक माइक्रोस्कोप (Nikon उपकरण इंक, SM2645) के तहत दिखाई देता है एक खोलने बनाने razorblade कट.
2. प्लेस 2 coverslip पर एक बूंद के रूप में अपने काम के समाधान के उल.
3. एक 5 एमएल सिरिंज एक चमड़े के नीचे सुई और थोड़ा काम समाधान के अपने ड्रॉप में micropipette के बाहर का टिप डूब पर टयूबिंग के साथ फिट करने के लिए एक micropipette के पीछे संलग्न. ख्याल रखना micropipette की नोक तोड़ नहीं.
4. सिरिंज के सवार खींच कर micropipette के बाहर का अंत के माध्यम से काम समाधान अपनाना.

भाग 5: micropipette इंजेक्शन की मात्रा औजार

1. खनिज तेल की एक बूंद (अमेरिकी Bioanalytical, इंक, AB00921 - +००,०२५) एक micrometer स्लाइड पर (फाई निकालें.शेर, 12-561-SM1).
2. शक्ति और हवा की आपूर्ति पर दबाव स्पंदित सूक्ष्म सुई लगानेवाला तंत्र (विश्व प्रेसिजन उपकरण इंक, PV830) के लिए मुड़ें.
3. सूक्ष्म सुई लगानेवाला तंत्र के micropipette धारक को micropipette संलग्न. सूक्ष्म सुई लगानेवाला और विनियमित निर्वहन पैर पेडल का उपयोग करके सक्रिय कर रहे हैं दबाव है.
4. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, सूक्ष्म सुई लगानेवाला का उपयोग करने के लिए सुक्ष्ममापी तेल पर अपने काम के समाधान की एक बूंद जगह इंजेक्शन की मात्रा का परीक्षण. ड्रॉप के व्यास उपाय के रूप में तेल के शीर्ष पर एक क्षेत्र के रूप में मंगाई.
5. अवधि और इंजेक्शन के दबाव को ध्यान से अपने इंजेक्शन की मात्रा जांचना समायोजित. यह कदम microinjection प्रयोग के reproducibility में एड्स. इस प्रदर्शन में, सभी microinjections 0.15 मिमी (1.76 लगभग मात्रा में nl) की एक बूंद व्यास के साथ किया जाएगा.
6. एक बार अपने इंजेक्शन की मात्रा कैलिब्रेटेड किया गया है, सूक्ष्म सुई लगानेवाला पर "पकड़ो" घुंडी उपयोग backfilling और micropipette लीक को रोकने के.

भाग 6: तैयारी निषेचित microinjection के लिए zebrafish भ्रूण

1. Zebrafish बेतरतीब ढंग से हर सुबह के पहले कुछ घंटों में दोस्त होगा. एक सेल मंच पर भ्रूण लीजिए और 1x E3 माध्यम में उन्हें जगह.
2. एक 3 एमएल हस्तांतरण pipet (Becton Dickinson Labware, 357,524) का उपयोग करना, microinjection चैम्बर प्लेटों में पच्चर के आकार का नली के साथ भ्रूण की व्यवस्था.
3. मध्यम ताकि भ्रूण shallowly और जलमग्न नहीं कर रहे हैं बाढ़ आ गई निकालें. यह कदम नली के नीचे अच्छी तरह के रूप में micropipette द्वारा chorion के प्रवेश में भ्रूण निपटाने में एड्स.

भाग 7: chorion के माध्यम से Microinjection

1. भ्रूण micropipette ताकि चरण 1 सेल भ्रूण के cytoplasm विदारक खुर्दबीन के नीचे दिखाई देता है के साथ हेरफेर. ख्याल रखना micropipette की नोक तोड़ नहीं.
2. और फिर micropipette साथ जर्दी chorion घुस्साघुस्सी क्रम में भ्रूण में इंजेक्षन. इस प्रदर्शन में, हम सीधे सेल नीचे की जर्दी में microinjecting पहली बार हो सकता है, और cytoplasmic प्रवाह और प्रसार की अनुमति सेल में काम कर समाधान लाने. यह प्रवाह phenol काम कर समाधान जोडी लाल के कारण दिखाई देता है.
3. हम भी सेल cytoplasm में प्रत्यक्ष इंजेक्शन का प्रदर्शन करेंगे. सेल में प्रत्यक्ष microinjection अधिक मजबूत है लेकिन उचित भ्रूण अभिविन्यास और microinjection तकनीक आवश्यक है के रूप में समय लेने वाली है. कोशिका झिल्ली के रूप में की जर्दी झिल्ली से अधिक कठोर है, यह अक्सर जल्दी जर्दी के माध्यम से micropipette दर्ज cytoplasm कोशिका तक पहुँचने. गर्त के नीचे की ओर पशु पोल orienting और स्थिर हाथ के साथ काम इंजेक्शन की इस पद्धति में सहायता कर सकते हैं.
4. Microinjection के बाद, E3 के माध्यम से एक पेट्री डिश में भ्रूण और जगह उन्हें 28.5 पर सेते ° सामान्य विकास के लिए सी.
5. अगले कई घंटे और भ्रूण के विकास के दिनों में, अपने हित के phenotypes के लिए भ्रूण का पालन करें.

8: भाग प्रतिनिधि परिणाम

EGFP mRNA overexpression: microinjection की सफलता को सत्यापित करने के लिए, हम विकासशील vivo में पूरे भ्रूण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में ढाल (~ 6 HPF) मंच पर शुरुआत भ्रूण में GFP की अभिव्यक्ति की निगरानी (Leica माइक्रोसिस्टम्स GmbH, MZFLIII). निर्माण के अभिव्यक्ति भ्रूण विकास के प्रारंभिक घटनाओं के दौरान सबसे मजबूत है और अक्सर विकास के दौरान कम हो जाएगा के रूप में इंजेक्शन छाया शाही सेना धीरे - धीरे अपमानित और प्रोटीन व्यक्त की स्थिरता पर निर्भर करता है.

pkd2 translational अवरुद्ध morpholino पहले प्रकाशित परिणामों के आधार पर, हम pkd2 morphants पृष्ठीय शरीर अक्ष के रूप में लगभग 2 बजे pkd2 उत्परिवर्ती zebrafish और वर्तमान गुर्दे अल्सर में पाया वक्रता नकल करने की ^{उम्मीद} है - 3 4 DPF.

चित्रा 1: EGFP mRNA और pkd2 अगस्त morpholino microinjection से प्रतिनिधि परिणाम. (क) TAB भ्रूण EGFP mRNA की 0.17 एनजी के साथ एक सेल मंच पर microinjected थे और vivo GFP अभिव्यक्ति में लिए 1 DPF में कल्पना . (ख, ग) TAB भ्रूण ~ 1.7 nl pkd2 translational अवरुद्ध morpholino के साथ एक सेल मंच पर microinjected 0.50 मिमी और 4 DPF पर पृष्ठीय शरीर वक्रता के लिए रन बनाए .

Discussion

Zebrafish भ्रूण में Microinjection विकास में एक विशेष जीन की भूमिका की खोज के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित और मजबूत तकनीक है. अनुप्रयोगों overexpression, misexpression, और के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई जीनों के बीच epistatic विश्लेषण के हित के अपने जीन की पछाड़ना assays शामिल हैं. Zebrafish में Microinjection व्यापक रूप से किया गया है ट्रांसजेनिक जानवर पैदा करने, ^और जल्दी ब्लासटुला 5,6,7,8,9 भ्रूण में सेल भाग्य मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, इस तकनीक का आवेदन कोशिका प्रत्यारोपण ¹⁰ विधियों द्वारा रोगाणु लाइन chimeras पैदा करने में एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में कार्य करता है.

एक जीन 'लाभ के समारोह' phenotype की खोज के लिए एक वैकल्पिक तरीका है कि जीन की constitutively सक्रिय रूपों microinject है. इसके अलावा, एक जीन के छद्म 'नुकसान के समारोह' phenotype है कि जीन की प्रमुख नकारात्मक रूपों के microinjection द्वारा पता लगाया जा सकता है. Zebrafish भ्रूण में Microinjection भी डीएनए और छोटे अणुओं ^11,12 शामिल हो सकते हैं.

इस microinjection तकनीक में एक महत्वपूर्ण कदम micropipette सुई की गुणवत्ता है. हम एक विंदुक खींचने डिवाइस के द्वारा आकार केशिका ट्यूब से हमारे micropipette बनाते हैं. यह आवश्यक है कि विंदुक खींचने ठीक इष्टतम सुई आकृति और आकार उपज के लिए calibrated है. Micropipettes है कि बहुत लंबा है और अक्सर कमी कठोरता संकीर्ण हैं, आसानी से तोड़ और chorion और जर्दी घुसना करने के लिए संघर्ष. लघु micropipettes अक्सर अधिक microinjection के दौरान भ्रूण को नुकसान पहुँचाए के लिए प्रवण हैं.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x E3 Medium	Reagent			5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue
All other materials are listed in the protocol.