Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.
Abstract
Een essentieel instrument voor het onderzoek naar de rol van een gen tijdens de ontwikkeling is de mogelijkheid om gen knockdown, overexpressie en misexpression studies uit te voeren. In zebravis (<em> Danio rerio</em>), Micro-injectie van RNA, DNA, eiwitten, antisense oligonucleotiden en andere kleine moleculen in de zich ontwikkelende embryo biedt onderzoekers een snelle en robuuste test voor het verkennen van genfunctie<em> In vivo</em>. In deze video-artikel zullen we zien hoe voor te bereiden en microinject<em> In vitro</em> Gesynthetiseerd EGFP mRNA en een translatie-blokkerende morfolino oligo tegen<em> PKD2</em>, Een gen geassocieerd met autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD), in een-cellig stadium zebravis embryo's. Wij zullen Vervolgens analyseren van het succes van het mRNA en morfolino-micro-injecties door te controleren of GFP expressie en fenotype-analyse. Brede toepassingen van deze techniek zijn onder het genereren van transgene dieren en kiem-lijn hersenschimmen, cel-lot in kaart brengen en gen-screening. Hierin beschrijven we een protocol voor overexpressie van EGFP en de knock-down van<em> PKD2</em> Door mRNA en morfolino oligonucleotide injectie.
Protocol
Deel 1: Voorbereiding van micropipetten, en micro-injectie kamer platen Fabriceren micropipetten door te verwarmen en te trekken borosilicaatglas capillaire buisjes (World precisie-instrumenten, Inc, 1B100-4) in een micropipet trekker apparaat (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97). Te slaan in een petrischaal op de top van kleine hoeveelheid klei of plakband. Giet 1,5% agarose (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) in 1x E3 medium platen gevormd met wigvormige troughs dat zal als een e…
Discussion
Micro-injectie in de zebravis embryo's is een gevestigde en robuuste techniek voor het verkennen van de rol van een bepaald gen in ontwikkeling. Toepassingen zijn onder andere overexpressie, misexpression en knockdown testen van uw gen van belang evenals epistatisch analyse tussen meerdere genen. Micro-injectie in de zebravis is op grote schaal gebruikt voor het genereren van transgene dieren, en in kaart brengen lot van de cel in het begin van blastula embryo's 5,6,7,8,9. Daarnaast is de toepassing v…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH en PKD stichting ZS. Alle dierlijke experimenten werden uitgevoerd volgens de Yale Animal Resources Center (YARC) en institutionele Dierverzorging en gebruik Comite (IACUC) richtlijnen.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
1x E3 Medium
Reagent
5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).