Summary
Микроинъекция является устоявшейся и эффективным методом для введения чужеродных веществ в оплодотворенных эмбрионов данио. Здесь мы демонстрируем надежной техники микроинъекции для выполнения мРНК гиперэкспрессия и морфолино олигонуклеотидных гена нокдаун исследований в данио.
Abstract
Важным инструментом для исследования роли генов в процессе развития является способность выполнять гена нокдаун, гиперэкспрессия и misexpression исследований. В данио (
Protocol
Часть 1: Подготовка микропипетки, и плиты микроинъекции камеры
- Изготовление микропипетки при нагревании и потянув боросиликатного стекла капилляров (World Precision Instruments, Inc, 1B100-4) в устройстве микропипетки съемник (Саттер инструменты Inc, Flaming / коричневый Р-97). Хранить в чашку Петри на вершине небольшого количества глины или липкой лентой.
- Залить 1,5% агарозы (American Bioanlytical, Inc AB00972-00500) в 1x E3 пластин среду формованные с клиновидным впадин, которые будут служить простой метод для проведения эмбрионы во время инъекции (как описано в "данио рерио книга") 1. Пусть пластины агара камеры укрепить, прежде чем использовать и хранить при температуре 4 º С.
Часть 2: Подготовка РНК
Один мощный подход для изучения функций генов является microinject в пробирке транскрипции РНК ограничен в данио эмбрионов. Capped РНК ведет себя подобно эукариотических мРНК содержится в естественных условиях из-за присутствия CAP аналог. Данио рерио ученые обычно используют этот метод для гиперэкспрессией или misexpress их гена. В этой демонстрации, мы будем microinject EGFP с метками стенограммы и использования живых целого эмбриона GFP-выражение, как видимый индикатор для успешных инъекций.
- Выполните в пробирке транскрипции РНК CAP реакции на стенограмму интерес. В нашей лаборатории мы обычно вставки кДНК интерес в вектор pCS2 + и выполняют в пробирке реакции синтеза больших количеств ограничен РНК с использованием mMessage mMachine SP6 комплект (Амбион, Inc AM1340).
- Очищение образца РНК, запустив его через RNeasy комплект Mini (Qiagen, Inc, 74104), или фенол: хлороформ добычи и изопропанола осадков.
- Тщательно определения концентрации РНК подготовки и хранить при температуре -80 ° С до готовности к использованию.
- В день инъекции, оттепель образцов РНК, вихревые легко и со спином вниз кратко.
- Подготовка рабочего раствора стерильной водой и конечной концентрации 0,025 - 0,050% фенола красного (Sigma-Aldrich Ко, P0290). Фенол красный служит видимым маркером для инъекции раствора в зародыше. В этой статье мы будем готовить рабочий раствор 100 нг / мкл EGFP мРНК с 0,050% фенола красного цвета.
- Продолжайте работать образца на льду и доходности акций РНК до -80 ° C.
- Переходите к Части 4, когда готовы внедрить этот образец.
Часть 3: Подготовка морфолино
Морфолино антисмысловых олигонуклеотидов широко используется для изменения экспрессии генов, блокируя перевод целевого белка или путем изменения пре-мРНК сплайсинга 2,3. Morpholinos в данио служить мощным инструментом обратной генетики сбить функции гена. В этой статье мы microinject морфолино олиго направлены на поступательное сайт инициирования PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). На основе ранее созданных работ, мы ожидаем, что инъекции эмбрионов фенотипически имитировать PKD2 мутант 4 рыбы.
- Мы регулярно порядка 300 нмоль морфолино олиго специально разработан для интересующего гена из генов Tools, LLC (Филомат, ИЛИ).
- Добавить 100 мкл стерильной воды, чтобы сделать 3 мМ маточного раствора. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до готовности к использованию.
- В день инъекции, тепловые решение морфолино при 65 ° С в течение 5 минут. Привязка прохладно на льду сразу же и спина кратко. Этот шаг денатурирует каких-либо второстепенных структур в олиго и гарантирует, что решение полностью растворяются.
- Подготовка рабочего раствора путем разбавления раствора морфолино в стерильной воде и конечной концентрации 0,025 - 0,050% фенола красного цвета. В этой демонстрации, мы будем готовить рабочий раствор 0,50 мм PKD2 морфолино с 0,050% фенола красного цвета.
- Держите рабочего раствора при комнатной температуре.
- Переходите к Части 4, когда готовы внедрить этот образец .----
Часть 4: Заполнение микропипетки с вашим рабочим раствором
- Вырезать дистального кончика микропипетки щипцами или хирургическое лезвие бритвы, чтобы создать открытие это только видимые под микроскопом рассекает (Nikon Instruments, Inc, SM2645) на 50X увеличением.
- Место 2 мкл вашего рабочего раствора, как падение на покровное.
- Прикрепите заднюю микропипетки на 5 мл шприца оснащен трубкой с иглой подкожно и слегка погрузиться дистального кончика микропипетки в ваши капли рабочего раствора. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончика микропипетки.
- Сифон рабочего раствора через дистального конца микропипетки, потянув поршень шприца.
Часть 5: Калибровка объема микропипетки инъекции
- Место каплю минерального масла (American Биоаналитическая, Inc AB00921-00025) на микрометр слайд (FiШер, 12-561-SM1).
- Включите питание и подачу воздуха к давлению импульсного микро инжектор аппарата (Всемирный точных приборов Inc, PV830).
- Прикрепите к микропипетки микропипетки обладатель аппарата микро форсунки. Микро форсунки давление регулируется и сбросов приводятся в действие нажатием педали.
- Под микроскопом вскрытие, тест объемом впрыска с помощью микро-форсунка на место падения вашего рабочего раствора на микрометр нефти. Измерьте диаметр капли, как он плавает, как сфера поверх масла.
- Отрегулируйте продолжительность и давление инъекции тщательно выверять вашу объема инъекции. Этот шаг помогает в воспроизводимости микроинъекции эксперимента. В этой демонстрации все микроинъекций будет сделано с каплей диаметром 0,15 мм (примерно 1,76 нл по объему).
- Как только Ваш объемом впрыска был откалиброван, используйте "Hold" ручку на микро-форсунка для предотвращения обратной засыпки и утечки микропипетки.
Часть 6: Подготовка оплодотворенных эмбрионов данио для микроинъекции
- Данио рерио будет случайным образом мат в первые несколько часов каждое утро. Сбор эмбрионов на 1-клеточной стадии и поместите их в 1x E3 среды.
- Использование 3 мл передачи пипетки (Becton Dickinson Лабораторное оборудование, 357524), организовать эмбрионы вместе клиновидных корыта в пластинах микроинъекции камеры.
- Удалить среду так, чтобы эмбрионы неглубоко погруженные и не затопило. Этот шаг помогает в решении эмбрионов на дно желоба, а также в проникновении хориона по микропипетки.
Часть 7: Микроинъекция через хориона
- Манипулирование эмбрионов с микропипетки, так что цитоплазма 1-клеточной стадии эмбриона видимые под микроскопом вскрытии. Будьте осторожны, чтобы не сломать кончика микропипетки.
- Проникнуть хориона, а затем желток с микропипетки для того, чтобы ввести в эмбрион. В этой демонстрации, мы будем первые microinjecting в желтке непосредственно под клетку, и позволяют цитоплазматических потока и диффузии для приведения рабочего раствора в клетку. Этот поток видна из-за фенола красного добавлены в рабочий раствор.
- Мы также продемонстрирует непосредственным впрыском в цитоплазме клетки. Прямая микроинъекции в клетку является более надежной, но трудоемким, поскольку правильную ориентацию эмбриона и микроинъекции техника не требуется. Как клеточной мембраны является более строгим, чем мембраны желтком, часто быстрее ввести микропипетки через желток достичь цитоплазме клетки. Ориентируемся животных полюс в нижней части желоба и работы с твердой рукой может помочь в таком способе введения.
- После микроинъекции, место эмбрионов в чашке Петри с E3 средних и инкубировать их в 28,5 ° С для нормального развития.
- В течение нескольких последующих часов и дней развития эмбриона, наблюдать эмбрионов для вашего фенотипы интерес.
Часть 8: Представитель результаты
EGFP мРНК гиперэкспрессия: Чтобы убедиться в успехе микроинъекции, мы будем контролировать экспрессию GFP в развивающихся эмбрионов, начиная с этапа щита (~ 6 HPF) путем в естественных условиях целого эмбриона флуоресцентной микроскопии (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Выражение построить наиболее сильным в начале событий эмбрионального развития и часто уменьшаются в процессе разработки, как вводили ограничен РНК постепенно разрушается и зависит от стабильности выразил белка.
PKD2 поступательного блокировки морфолино: на основе ранее опубликованных результатов, мы ожидаем, PKD2 morphants имитировать спинной кривизны оси тела, которые содержатся в PKD2 мутанта данио и настоящего кист почек примерно в 2 - 3 DPF 4.
Рисунок 1: представитель результате микроинъекции EGFP мРНК и PKD2 августа морфолино. () TAB эмбрионов microinjected на 1-клеточной стадии с 0,17 нг EGFP мРНК и визуализируется на 1 денье для выражения в естественных условиях GFP. (Б, в) TAB эмбрионов microinjected на 1-клеточной стадии с ~ 1,7 п от PKD2 поступательного блокирование морфолино на 0,50 мм и забил на спинной кривизны тела в 4 денье.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Микроинъекция в данио эмбрионов устоявшиеся и надежные методики изучения роли конкретного гена в развитии. Приложения включают гиперэкспрессия, misexpression и нокдаун анализы вашего интересующего гена, а также анализ эпистатических между несколькими генами. Микроинъекция в данио широко используется для создания трансгенных животных, а также отображение ячейки судьба в ранней бластулы эмбрионов 5,6,7,8,9. Кроме того, применение этого метода является ключевым шагом в создании зародышевой линии химеры по трансплантации клеток методами 10.
Один из вариантов метода для изучения фенотипа гена "получить-функции" заключается в microinject конститутивно активные формы этого гена. Кроме того, псевдо-гена "потерей функции" фенотип может быть изучены микроинъекции доминирующим отрицательные формы этого гена. Микроинъекция в данио эмбрионы могут также включать ДНК и малых молекул, 11,12.
Важным шагом в этом микроинъекции техника качества иглу микропипетки. Мы делаем наши микропипетки из капилляров формируются устройством съемника пипетки. Очень важно, чтобы съемник пипетки правильно откалиброван для получения оптимальной форме иглы и размер. Микропипетки, которые являются слишком длинными и узкими часто не хватает жесткости, легко ломаются и борьбы проникнуть хориона и желток. Короткие микропипетки часто являются более склонными к повреждениям эмбриона во микроинъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH и PKD основу для ZS. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Йеле животных ресурсов Центра (YARC) и Уходу за животными и использование комитета (IACUC) руководящих принципов.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
||
| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
