이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.
공부 zebrafish의 장점 중 하나는 배아에서 단백질 수준을 조작의 용이성과 속도입니다. 대상 RNAS에 안티 센스 complementarity과 합성 oligonucleotides 아르 Morpholinos는, 특정 유전자 산물의 표현을 줄이기 위해 배아에 추가할 수 있습니다. 반대로, 처리 mRNA는 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 배 (胚)에 추가할 수 있습니다. 배아에 mRNA 또는 morpholino 중 하나를 추가하는 차량 microinjection입니다. Microinjection은 시간당 배아들 중 수백명의 주입 수있게 효율적이고 빠른 속도입니다. 이 비디오는 microinjection에 관련된 모든 단계를 보여줍니다. 간단히, 달걀이 마련되는 즉시 수집하여 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 대항 줄지어 있습니다. 다음 사출 소재로 로드된 미세 스쳐 바늘은 microinjector와 공기 소스에 연결하고 microinjector 컨트롤은 바람직한 사출 볼륨을 생산하기 위해 조정됩니다. 마지막으로, 바늘은 배아의 노른자 속으로 뛰어들었다이며 morpholino 또는 mRNA 퇴학입니다.
zebrafish 모델 시스템의 장점 중 하나는 특정 유전자 제품에 추가하거나 microinjection하여 배아에서 제거될 수있는 용이입니다. ubiquitously 특정 단백질을 overexpress하려면, mRNA 인코딩 그것은 1 세포 단계에서 노른자로 주입됩니다. 배아의 후속 개발 과정에서 RNA는 유기체에 걸쳐 분산 및 번역입니다. 반대로, 특정 단백질을 제거하기 위해, morpholinos이 사용됩니다. Morpholinos 특정 RNAS에 안티 센스 complementarity 설계 합성 oligonucleotides 있습니다. mRNAs 마찬가지로, morpholinos는 1 세포 단계에서 노른자에 주입하고 있습니다. 배아 내부 그들은 번역을 방지하는 그들의 목표 RNAS를 바인딩합니다.
각 morpholino 또는 mRNA를 위해 만들어진 있어야 주요 수정 주입 물질의 농도이다. morpholino 또는 mRNA 중 하나 너무 높은 농도가 아닌 특정 독성을 일으킬 수 있으며, 각 morpholino가 아닌 특정 결함을 유발하지 않고 효과적으로 유전자 활동을 허물고 그 최적 농도, 200 μm의 500 μm의 사이에 일반적으로 morpholino의 농도를 결정하기 위해 경험적으로 테스트해야하는 동안. 바늘 오프닝의 정확한 크기는 중요하지 않습니다. 바늘 크기, 분사 압력 및 사출 시간의 범위 내에서 정확한 볼륨 볼러스을 생산하기 위해 조정할 수 있습니다.
Morpholinos은 단백질 내에 도메인의 기능 해부 등 많은 애플 리케이션을 보유하고 있습니다. 특정 엑손 – 인트론 분기점을 대상으로 설계하면 morpholinos가 발생 splicing을 방지할 수 있습니다. 우린 두 morpholinos의 영향을 조사되는 heg의 사전 mRNA에 바인딩하는 엑손 – 인트론 분기점. morpholino heg_e3i3_egfr1는 성숙한 성적에 엑슨 3 통합의 splicing 기계 방지, 엑슨 3 인트론 세 사이의 접합을 바인딩합니다. morpholino heg_e4i4_egfr2는 비슷하게 엑슨 사를 제거합니다. exons 3, 4 모두 EGF와 같은 반복을 포함하는 도메인을 인코딩. 일부 배아는 heg_e4i4_egfr2 알맞게 phenocopy 돌연변이와 함께 주입, 추가 실험은 심장 개발에 엑슨 4 Heg의 역할을 이해해야합니다. 놀랍게도, heg_e3i3_egfr1 주사 배아는 뇌 부종, heg 돌연변이에 보지 기능이 있습니다. 이 접합자의 돌연변이에 영향을받지 될 산모 기록을 바인딩하는 morpholinos의 능력으로 인해 발생했을 수 있습니다.
우리가 그들의 기술 지원에 대한 마블리 실험실과 Narie 스톨러의 회원을 인정하고, 미국 심장 협회 (NCRP 과학자 개발 그랜트 0635363N)과 국립 심장, 폐, 그리고 자금에 대한 혈액 연구소 (부여 SCCOR RFA HL02 – 027).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
Micromanipulator | Tool | Narishige | MN 153 | |
Needle Puller | Tool | Sutter Instruments | P 97 | |
Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100 F6 | |
Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
Needle Holder | Tool | World Precision Instruments | MPH310 |