Micro-injectie van de zebravis embryo's Gene functie analyseren

Summary

Deze video laat zien hoe morfolino of mRNA kan worden geïnjecteerd in zebravis embryo's in het een-cellig stadium te verlagen of te verhogen van het niveau van specifieke gen-producten tijdens de verdere ontwikkeling.

Abstract

Een van de voordelen van het bestuderen van zebravis is het gemak en de snelheid van het manipuleren van eiwit niveaus in het embryo. Morpholinos, die synthetische oligonucleotiden met antisense complementariteit te richten RNA's, kunnen worden toegevoegd aan het embryo om de expressie van een bepaald gen product te verminderen. Omgekeerd kan verwerkt mRNA worden toegevoegd aan het embryo tot het niveau van een gen product te verhogen. Het voertuig voor het toevoegen van een mRNA of morfolino-tot een embryo is micro-injectie. Micro-injectie is een efficiënte en snelle, waardoor voor de injectie van honderden embryo's per uur. Deze video laat alle stappen die betrokken zijn bij micro-injectie. Kortom, worden de eieren immediately verzameld na het leggen en gevoerd tegen een microscoop dia in een petrischaal. Vervolgens is een fijne punt naald geladen met injectiemateriaal verbonden aan een microinjector en een lucht-bron, en de microinjector controles worden aangepast om een ​​wenselijke injectie volume te produceren. Ten slotte wordt de naald ondergedompeld in dooier van de embryo's en de morfolino-of mRNA wordt uitgezet.

Protocol

Deel 1: productie van eieren en het verzamelen

1. De nacht voorafgaand aan de injectie, het opzetten van de vissen in het fokken van tanks met verdeelschotten op zijn plaats. Ter verhoging van de totale productie van eieren, kunnen vissen worden ingesteld in een verhouding van twee vrouwtjes om een ​​mannetje indien gewenst.
2. De volgende ochtend, zet na de kamer lampjes op, trek de verdelers van verschillende tanks en laat ongeveer 20 minuten ongestoord paartijd.
3. Met behulp van een zeef, het verzamelen van de eieren van de kweek kooien en spoel ze met ei water. Giet de eieren in een petrischaal met ei water en verwijder onbevruchte eieren en vuil met een transfer pipet. Vis kunnen worden gegroepeerd in grotere tanks om extra rondes van eieren voor injectie te produceren. De timing van ei collectie toe te staan ​​voor een maximale hoeveelheden eieren worden geproduceerd, zonder hen te laten passeren de enkele cel stadium.
4. Plaats een microscoop dia in de omgekeerde deksel van een 100mm petrischaal. Gebruik een transferpipet aan line-up van de eieren tegen de zijkant van de glijbaan het vormen van een enkele kolom. Verwijder overtollig water uit het ei dia door het indrukken van een Kimwipe tegen de zijde tegenover de eieren. (Figuur 1A)

Deel 2: Naald trekken, laden, en voorbereiding

1. Met een micropipet trekker, trek een 1,0 mm OD glazen capillaire in twee naalden en op te slaan in een 150mm petrischaal door het leggen van meer dan Silly Putty hellingen. Naalden kunnen worden getrokken op voorhand.
2. Frictie van de naald met 3 pi van injectie materiaal met behulp van een microloader pipet. Schud de bolus in de richting van de naald totdat er weinig of geen luchtbellen blijven.
3. Zet de lucht bron en microinjector. Steek de naald in de microinjector en verzekeren een goede afdichting in het huis. Controleer of de micromanipulator is in een goede positie om voor een breed scala van beweging en aanpassing. Breng de naald in het vlak van uitzicht op de microscoop, hoog boven het podium, en de focus op het dunste deel van de tip. Gebruik een paar scherpe tang knijpen af ​​van de naald op een punt die vertrekt van de naald smal genoeg te doorboren het chorion en het eigeel, maar nog steeds in staat van het leveren van een consistente kraal grootte. Een druppel van minerale olie op een micrometer kan worden gebruikt om het volume van elke injectie te berekenen. Bij injectie in de olie, een kraal met een diameter van 0,1 mm bevat 500 pL van injectie materiaal (figuur 1B); injectie volume van 500 PL of 1nL worden doorgaans gebruikt. Druk het voetpedaal en toezicht op de grootte van de kraal, terwijl het trimmen van de naald en het aanpassen van de injectie druk als dat nodig is. Ideaal injectie volumes zal vullen circa 10% van het ei volume. De kwaliteit van de naald is cruciaal voor zowel het gemak van de injectie en de kwaliteit en consistentie van de resultaten.

Deel 3: Injectie

1. Zorg ervoor dat de embryo's niet ontwikkeld langs de vier-cellig stadium. Idealiter zou embryo's zijn op de een-cellig stadium.
2. Laat de naald naar de kolom van eieren, die de schotel op zijn plaats met uw andere hand.
3. Pierce het oppervlak van het chorion en voer de dooier in een vloeiende slag tijdens het kijken voor eventuele breken of scheuren van de dooierzak. Injecteer de injectie materiaal in de dooier (figuur 1C). Vermijd het injecteren van luchtbellen of strekken van de dooier als ofwel kan dodelijk zijn voor het embryo. Werken langs de lijn, pas de druk die nodig is om een ​​consistente kraal grootte en, met behulp van een pipet tip te behouden, verwijder dan de eieren die er onbevruchte of worden vernietigd tijdens de injectie proces.
4. Na het voltooien van een kolom van eieren, gebruik dan een zachte stroom van ei water om de geïnjecteerde eitjes te verplaatsen naar een schone petrischaal. Herhalen als nodig is. Houden verschillende uninjected embryo's als een controle. Aan het eind van dag een, verwijderen dode embryo's en het registreren van het aantal geïnjecteerde embryo's. Vervang het ei water in de schaal periodiek om de kans op infectie te verkleinen.

Deel 4: Representatieve resultaten

Afhankelijk van wat er wordt ingespoten, kunnen embryo's overleven tegen een lager tarief dan hun uninjected broers en zussen. Gelukkig is het gemakkelijk is om te injecteren grote aantallen van hen, dus dit is zelden een probleem. Het is normaal dat morphants te exposeren licht vertraagde ontwikkeling.

Ter illustratie van de resultaten van micro-injectie, gebruikten we dit protocol tot het niveau van het eiwit Hart van Glas (Heg) te manipuleren. HEG is een transmembraan eiwitten die nodig zijn voor een normale ontwikkeling van het hart. Bij gebreke daarvan, embryo's te ontwikkelen harten met gigantische instroom traktaten en Kamers ^1. We hebben twee niet eerder beschreven morpholinos geïnjecteerd tegen HEG, heg_e3i3_egfr1 en heg_e4i4_egfr2, bij een concentratie van 500 uM. Op twee dagen na de bevruchting, de uninjected broer of zus controleert normaal lijken, zoals verwacht (figuur 2A en B). Embryo's geïnjecteerd met heg_e3i3_egfr1 hebben hersenoedeem (figuur 2C). Hoewel de harten van de meeste van deze morphants hebben morfologie veranderd, hun kamers zijn normaal formaat (figuur 2D). Embryo's geïnjecteerdmet heg_e4i4_egfr2 vertonen variabele hartafwijkingen. Sommige normaal lijken, terwijl anderen hebben grote instroom landstreken en matig vergroot atria (figuur 2E en F). Het HEG mutant, zoals eerder gemeld ^een, heeft een enorm vergrote instroom-darmkanaal en het atrium (zie figuur 2G en H).

We hebben ook geïnjecteerd wildtype embryo's met 400 ng / ul mRNA getranscribeerd van de volledige lengte cDNA HEG. Terwijl uninjected controles normaal ontwikkelen (figuur 3A en B), embryo geïnjecteerd met HEG mRNA vertonen een spectrum van fenotypen, variërend van wildtype verschijning aan ernstige cyclopie, verkorting van de belangrijkste lichaam as, necrose van het hoofd en lichaam, en middellijn afwijkingen (figuur 3C en D).

Figuur 1. Embryo's worden geïnjecteerd worden opgesteld tegen een microscoop dia in een petrischaal (A). Injectie volume wordt bepaald door het injecteren in de minerale olie op een micrometer. Een injectie volume van 500 pL, die gewoonlijk wordt gebruikt, heeft een diameter van 0,1 mm (B). Onmiddellijk na de injectie, de morfolino-of mRNA is zichtbaar als een onderstrepen plek in de dooier (C).

Figuur 2. Op twee dagen na de bevruchting, embryo's uninjected hebben geen grove gebreken (A) of hart-fenotype (B). Embryo's geïnjecteerd met het morfolino heg_e3i3_egfr1 hebben hersenoedeem (C, pijl) maar normaal formaat hartkamers (D). Sommige embryo geïnjecteerd met het morfolino heg_e4i4_egfr2 een vergrote instroom traktaten en atria (E, F). HEG mutanten hebben ernstig vergrote instroom traktaten en atria (G, H). (A), (C), (E), en (G) zijn 4x DIC beelden; (B), (D), (F) en (H) zijn 20x DIC beelden. a = atrium, het = instroom-darmkanaal.

Figuur 3. Na 24 uur na de bevruchting, embryo's uninjected hebben een lange, rechte lichaam zonder necrose of middellijn defecten (A) en twee duidelijk omschreven ogen met een neurale buis tussen hen (B). Sommige embryo geïnjecteerd met HEG mRNA, daarentegen, vertonen een verkorte lichaamsas, necrose, misvormde somieten (C), en cyclopie (D). (A) en (C) zijn 4x DIC beelden; (B) en (D) zijn 20x DIC beelden.

Discussion

Een van de sterke punten van de zebravis model systeem is het gemak waarmee specifiek gen producten kunnen worden toegevoegd of verwijderd uit het embryo door micro-injectie. Om rode draad overexpressie een bepaald eiwit, het mRNA dat codeert het wordt geïnjecteerd in de dooier op de een-cellig stadium. Tijdens de daaropvolgende van de embryo's ontwikkeling, wordt het RNA verdeeld over het organisme en vertaald. Omgekeerd, een bepaald eiwit te elimineren, worden morpholinos gebruikt. Morpholinos zijn synthetische oligonucleotiden ontworpen met antisense complementariteit met specifieke RNA's. Net als mRNA's worden morpholinos geïnjecteerd in de dooier op de een-cellig stadium. Binnen de embryo ze binden hun doel RNA's, het voorkomen van vertaling.

De belangrijkste wijziging die moet worden gemaakt voor elke morfolino of mRNA is de concentratie van de geïnjecteerde materiaal. Een te hoge concentratie van een van beide morfolino-of mRNA kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit, terwijl iedere morfolino moet empirisch worden getest om de optimale concentratie, meestal morfolino concentraties tussen 200 en 500 uM uM bepalen knock down gen-activiteit effectief zonder dat niet-specifieke afwijkingen. De precieze grootte van de naald opening is niet cruciaal. Binnen een bereik van naald maten, inspuitdruk en injectie tijd kan worden aangepast om een ​​bolus van het juiste volume te produceren.

Morpholinos hebben vele toepassingen, waaronder de functionele ontleding van domeinen binnen een eiwit. Indien ontworpen voor specifieke exon-intron knooppunten te pakken zal morpholinos voorkomen dat splicing zich voordoet daar. We hebben gekeken naar de effecten van twee morpholinos die zich binden exon-intron knooppunten in het pre-mRNA van HBG. De morfolino heg_e3i3_egfr1 bindt de kruising tussen exon 3 en intron 3, het voorkomen van de splicing machines van integratie van exon 3 tot rijpe transcripten. De morfolino heg_e4i4_egfr2 verwijdert dezelfde exon 4. Zowel de exonen 3 en 4 coderen domeinen die EGF-achtige herhalingen. Sommige embryo geïnjecteerd met heg_e4i4_egfr2 matig phenocopy de mutant, verdere experimenten vereist zal zijn om de rol van de Heg exon 4 in ontwikkeling van het hart te begrijpen. Verrassend, embryo geïnjecteerd met heg_e3i3_egfr1 hebben hersenoedeem, een feature niet gezien in HEG mutanten. Dit kan te wijten zijn aan het vermogen van morpholinos van moeders transcripties dat zou beïnvloed zijn in zygotische mutanten te binden.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310