유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

Summary

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

Abstract

공부 zebrafish의 장점 중 하나는 배아에서 단백질 수준을 조작의 용이성과 속도입니다. 대상 RNAS에 안티 센스 complementarity과 합성 oligonucleotides 아르 Morpholinos는, 특정 유전자 산물의 표현을 줄이기 위해 배아에 추가할 수 있습니다. 반대로, 처리 mRNA는 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 배 (胚)에 추가할 수 있습니다. 배아에 mRNA 또는 morpholino 중 하나를 추가하는 차량 microinjection입니다. Microinjection은 시간당 배아들 중 수백명의 주입 수있게 효율적이고 빠른 속도입니다. 이 비디오는 microinjection에 관련된 모든 단계를 보여줍니다. 간단히, 달걀이 마련되는 즉시 수집하여 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 대항 줄지어 있습니다. 다음 사출 소재로 로드된 미세 스쳐 바늘은 microinjector와 공기 소스에 연결하고 microinjector 컨트롤은 바람직한 사출 볼륨을 생산하기 위해 조정됩니다. 마지막으로, 바늘은 배아의 노른자 속으로 뛰어들었다이며 morpholino 또는 mRNA 퇴학입니다.

Protocol

1 부 : 달걀 생산과 수집

1. 사전 주사하는 밤, 장소에 디바이더와 탱크를 번식에 물고기를 설정합니다. 원하는 경우 총 계란의 생산을 증가하기 위해 생선 한 남성 두 여성의 비율에서 설정할 수 있습니다.
2. 다음날 아침은 객실 조명 후 켜십 여러 탱크에서 디바이더를 뽑아 그대로 짝짓기 시간 약 20 분 동안 수 있습니다.
3. 스트레이너를 사용하여 번식 케이지에서 달걀을 수집하고 달걀 물로 그들을 씻어. 계란 물을 페트리 접시에 계란을 붓고 및 전송 피펫과 unfertilized 계란과 부스러기를 제거합니다. 생선은 사출 달걀의 추가 라운드를 생성하기 위해 큰 탱크에 regrouped 수 있습니다. 그들이 단세포 단계를 통과시키는 않고 생산되는 달걀의 최대 숫자 수 있도록 계란 컬렉션의 타이밍을 조정합니다.
4. 100mm 페트리 접시의 뚜껑에 거꾸로 현미경 슬라이드를 놓습니다. 하나의 컬럼을 형성 슬라이드의 측면에 대한 계란 라인에 전송 피펫을 사용합니다. 계란 반대 측면에 대한 Kimwipe을 눌러 슬라이드에서 여분의 계란 물을 제거합니다. (그림 1A)

2 부 : 니들이 로딩, 당기 및 준비

1. micropipette의 풀러와 어리석은 퍼티의 경사로를 통해 누워하여 150mm 페트리 접시에 두 바늘과 가게에 모세관 1.0mm OD 유리를 가져옵니다. 바늘은 사전에 뽑아하실 수 있습니다.
2. microloader의 피펫을 사용하여 사출 재료 3 μL와 Backload 바늘. 나머지 거의 또는 전혀 거품이 때까지 바늘 끝 방향으로 볼러스 흔들어.
3. 공기 소스와 microinjector를 켜십시오. microinjector에 바늘을 삽입하고 하우징 내에 꽉 인감을 확보. micromanipulator은 움직임과 조정의 광범위한 수 있도록 적절한 위치에 있는지 확인합니다. 무대에서 높은 현미경의 시야 비행기, 그리고 팁의 얇은 영역에 초점에 바늘 끝을 가져와. 바늘은 피어스 chorion와 노른자 정도로 좁은하지만 일관된 비드 크기를 전달할 수 아직도 단풍 지점에서 바늘을 공략하기 날카로운 집게 한 쌍의을 사용합니다. 마이크로 미터에서 미네랄 오일 방울은 각 주입의 볼륨을 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 오일에 주입하면, 0.1 mm의 직경을 가진 구슬은 사출 재료 500 PL (그림 1B)를 포함, 500 PL 또는 1nL의 사출 볼륨은 일반적으로 사용됩니다. 발 페달을 우울하게하고 바늘을 트리밍하고 필요에 따라 분사 압력을 조정하는 동안 비드의 크기를 모니터링합니다. 이상적인 분사 볼륨 계란 볼륨의 약 10 %를 채울 것입니다. 바늘 끝의 품질은 주입의 용이성과 결과의 품질과 일관성 모두에게 중요합니다.

파트 3 : 사출

1. 배아는 네 개의 세포 단계 과거 개발하지 않았습니다. 확인 이상적으로, 태아는 한 세포 단계에서해야합니다.
2. 당신의 반대 손으로 장소에서 접시를 들고, 계란의 열 방향으로 바늘을 낮춥니다.
3. 피어스 chorion의 표면 및 파쇄 또는 난황의 끊어지고위한 보면서 한 부드러운 스트로크의 노른자를 입력합니다. 난황 (그림 1C)에 주입 물질을 주사. 기포를 주입하거나 중 배아에 치명 수 있으므로 노른자를 스트레칭하지 마십시오. 선을 작업, 피펫 팁을 사용하여 일관성있는 구슬의 크기와를 유지하기 위해 필요한 압력을 조정 unfertilized 모양 또는 사출 과정에서 파괴 계란을 제거합니다.
4. 계란의 칼럼을 마친 후, 깨끗한 페트리 접시에 주입 계란을 이동 계란 물을 부드러운 스트림을 사용합니다. 필요에 따라 반복합니다. 컨트롤과 같은 여러 uninjected 배아 보관하십시오. 하루에 한의 끝에, 죽은 태아를 제거하고 주입 배아의 수를 기록합니다. 정기적으로 감염의 기회를 줄이기 위해 접시에 계란 물을 교체합니다.

4 부 : 대표 결과

주입되는 내용에 따라 배아들은 uninjected 형제보다 낮은 속도로 살아남을 수 있습니다. 다행히도, 그것이 그들의 큰 숫자를 주입하기 쉬우며, 이것이 거의 문제가 없다 그래서. morphants이 약간 지연 발전을 전시하는 것은 정상입니다.

microinjection의 결과를 설명하기 위해, 우리는 유리의 단백질 하트 (Heg)의 수준을 조작하기 위해이 프로토콜을 사용합니다. Heg 정상 심장 개발에 필요한 transmembrane 단백질이다. 의 부재에서 배아는 거대한 유입 책자와 챔버 ¹ 마음을 개발할 수 있습니다. 우리는 500 μm의의 농도에 heg, heg_e3i3_egfr1 및 heg_e4i4_egfr2, 둘은 반대 이전에 undescribed morpholinos를 주입했다. 2 일 게시물 수정에서 uninjected 형제 컨트롤은 (그림 2A와 B) 예상, 정상 나타납니다. heg_e3i3_egfr1 주사 태아가 뇌의 부종 (그림 2C)를했습니다. 이러한 morphants 대부분의 마음은 형태 변경했지만, 그들의 챔버 (그림 2D) 일반적으로 크기입니다. 공룡의 태아가 주입heg_e4i4_egfr2 전시 변수 심장 결함과 함께. 다른 대규모 유입 책자와 적당히 확대 심방 (그림 2E 및 F)를하는 동안 일부는 정상 나타납니다. 로 이전 ^1보고 heg 돌연변이, 방영 권 확대 유입 트랙트와 아트리움 (그림 2G 및 H)이 있습니다.

우리는 또한 cDNA 전체 길이 heg에서 베꼈는데 400 NG / μL mRNA와 wildtype 배아를 주입했다. uninjected 컨트롤이 정상적으로 개발하는 동안 (그림 3A와 B), 배아는 본체의 축, 머리와 신체의 괴사 및 정중선의 결함 (그림 3C의 단축, mRNA는 wildtype 모양에서 심각한 cyclopia에 이르기까지 phenotypes의 스펙트럼을 전시 heg로 주입 와 D).

주입하는 그림 1. 태아는 배양 접시에있는 현미경 슬라이드 (A) 상대 줄지어 있습니다. 사출 볼륨은 마이크로 미터에 위치 미네랄 오일에 주입에 의해 결정됩니다. 일반적으로 사용되는 500 PL,의 주사 량은 0.1 mm (B)의 직경이 있습니다. 즉시 주사 후 morpholino 또는 mRNA의 노른자 (C)에서 구두점 명소로 볼 수 있습니다.

그림 2. 2 일 게시물 수정에서 uninjected 배아는 아무런 총 결함 (A) 또는 심장 표현형 (B)가 없습니다. morpholino heg_e3i3_egfr1 주사 태아가 뇌의 부종 (C, 화살표)하지만 일반적으로 크기의 심장 회의소 (D)를했습니다. morpholino heg_e4i4_egfr2 주사 어떤 배아는 확대 유입 책자 및 심방 (E, F)가. heg 돌연변이 심각하게 확대 유입 책자와 심방을 (G, H) 있습니다. (A), (C), (E) 및 (G) 4X DIC 이미지되며 (B), (D), (F)과 (H) 20x DIC 영상입니다. = 아트리움, 그건 = 유입 트랙트.

그림 3. 24 시간 게시물 수정에서 배아 그들 (B) 사이에 신경 튜브와 노 괴사 또는 정중선 결함 (A) 두 명확하게 정의된 눈을 가진 긴 직선 신체를 uninjected. heg mRNA 주사 어떤 배아는 반대로, 짧은 몸 축, 괴사, misshaped somites (C), 그리고 cyclopia (D)를 나타냅니다. (A)와 (C) 4X DIC 이미지되며 (B)와 (D) 20x DIC 이미지입니다.

Discussion

zebrafish 모델 시스템의 장점 중 하나는 특정 유전자 제품에 추가하거나 microinjection하여 배아에서 제거될 수있는 용이입니다. ubiquitously 특정 단백질을 overexpress하려면, mRNA 인코딩 그것은 1 세포 단계에서 노른자로 주입됩니다. 배아의 후속 개발 과정에서 RNA는 유기체에 걸쳐 분산 및 번역입니다. 반대로, 특정 단백질을 제거하기 위해, morpholinos이 사용됩니다. Morpholinos 특정 RNAS에 안티 센스 complementarity 설계 합성 oligonucleotides 있습니다. mRNAs 마찬가지로, morpholinos는 1 세포 단계에서 노른자에 주입하고 있습니다. 배아 내부 그들은 번역을 방지하는 그들의 목표 RNAS를 바인딩합니다.

각 morpholino 또는 mRNA를 위해 만들어진 있어야 주요 수정 주입 물질의 농도이다. morpholino 또는 mRNA 중 하나 너무 높은 농도가 아닌 특정 독성을 일으킬 수 있으며, 각 morpholino가 아닌 특정 결함을 유발하지 않고 효과적으로 유전자 활동을 허물고 그 최적 농도, 200 μm의 500 μm의 사이에 일반적으로 morpholino의 농도를 결정하기 위해 경험적으로 테스트해야하는 동안. 바늘 오프닝의 정확한 크기는 중요하지 않습니다. 바늘 크기, 분사 압력 및 사출 시간의 범위 내에서 정확한 볼륨 볼러스을 생산하기 위해 조정할 수 있습니다.

Morpholinos은 단백질 내에 도메인의 기능 해부 등 많은 애플 리케이션을 보유하고 있습니다. 특정 엑손 - 인트론 분기점을 대상으로 설계하면 morpholinos가 발생 splicing을 방지할 수 있습니다. 우린 두 morpholinos의 영향을 조사되는 heg의 사전 mRNA에 바인딩하는 엑손 - 인트론 분기점. morpholino heg_e3i3_egfr1는 성숙한 성적에 엑슨 3 통합의 splicing 기계 방지, 엑슨 3 인트론 세 사이의 접합을 바인딩합니다. morpholino heg_e4i4_egfr2는 비슷하게 엑슨 사를 제거합니다. exons 3, 4 모두 EGF와 같은 반복을 포함하는 도메인을 인코딩. 일부 배아는 heg_e4i4_egfr2 알맞게 phenocopy 돌연변이와 함께 주입, 추가 실험은 심장 개발에 엑슨 4 Heg의 역할을 이해해야합니다. 놀랍게도, heg_e3i3_egfr1 주사 배아는 뇌 부종, heg 돌연변이에 보지 기능이 있습니다. 이 접합자의 돌연변이에 영향을받지 될 산모 기록을 바인딩하는 morpholinos의 능력으로 인해 발생했을 수 있습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Microinjector	Tool	Harvard Apparatus	PLI 100
Micromanipulator	Tool	Narishige International	MN 153
Needle Puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P 97
Glass Capillaries	Tool	World Precision Instruments, Inc.	TW100 F6
Microloader Pipettes	Tool	Eppendorf	5242956.003
Needle Holder	Tool	World Precision Instruments, Inc.	MPH310