इस वीडियो से पता चलता है कैसे morpholino या mRNA एक सेल के बाद विकास के दौरान विशिष्ट जीन उत्पादों के स्तर में कमी या वृद्धि चरण में zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है.
अध्ययन zebrafish का लाभ आसानी और भ्रूण में प्रोटीन के स्तर से छेड़छाड़ की गति है. Morpholinos, जो लक्ष्य RNAs antisense के complementarity के साथ सिंथेटिक oligonucleotides कर रहे हैं भ्रूण करने के लिए जोड़ा जा सकता है के लिए एक विशेष जीन उत्पाद की अभिव्यक्ति को कम है. इसके विपरीत, संसाधित mRNA भ्रूण करने के लिए जोड़ा जा सकता है एक जीन उत्पाद के स्तर में वृद्धि. वाहन microinjection एक भ्रूण या तो mRNA या morpholino जोड़ने के लिए है. Microinjection कुशल और तेजी से है, प्रति घंटे भ्रूण के सैकड़ों के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है. यह वीडियो सभी microinjection में शामिल कदम से पता चलता है. संक्षेप में, अंडे तुरंत बाद दिया जा रहा एकत्र कर रहे हैं और एक पेट्री डिश में एक खुर्दबीन स्लाइड के खिलाफ लाइन में खड़ा है. अगले, एक ठीक इत्तला दे दी इंजेक्शन सामग्री के साथ भरी हुई सुई एक microinjector और एक एयर स्रोत जुड़ा हुआ है, और microinjector को नियंत्रित करने के लिए एक वांछनीय इंजेक्शन की मात्रा का उत्पादन करने के लिए समायोजित कर रहे हैं. अंत में, सुई भ्रूण की जर्दी में डूब जाता है और morpholino या mRNA निष्कासित कर दिया है.
Zebrafish मॉडल प्रणाली की ताकत कितनी आसानी के साथ जो विशिष्ट जीन उत्पादों में जोड़ा जा सकता है या microinjection द्वारा भ्रूण से सफाया है. सर्वत्र एक विशेष प्रोटीन overexpress, mRNA एन्कोडिंग जर्दी में एक सेल मंच पर इंजेक्शन है. भ्रूण के बाद विकास के दौरान, शाही सेना जीव भर में वितरित किया जाता है और अनुवाद. इसके विपरीत, एक विशेष प्रोटीन को खत्म करने के लिए, morpholinos उपयोग किया जाता है. Morpholinos सिंथेटिक oligonucleotides antisense विशिष्ट RNAs के complementarity के साथ तैयार कर रहे हैं. MRNAs तरह morpholinos की जर्दी में एक सेल चरण में इंजेक्ट कर रहे हैं. भ्रूण के अंदर वे अपने लक्ष्य RNAs बाँध, अनुवाद को रोकने.
मुख्य संशोधन की जरूरत है कि प्रत्येक morpholino या mRNA के लिए बनाया जा इंजेक्शन सामग्री की एकाग्रता है. बहुत उच्च या तो morpholino या mRNA की एकाग्रता गैर विशिष्ट विषाक्तता का कारण हो सकता है, जबकि प्रत्येक morpholino empirically परीक्षण किया जाना चाहिए करने के लिए अपने इष्टतम एकाग्रता, आम तौर पर 200 सुक्ष्ममापी और 500 सुक्ष्ममापी के बीच morpholino सांद्रता का निर्धारण गैर विशिष्ट दोष के कारण के बिना नीचे जीन गतिविधि दस्तक प्रभावी ढंग से. सुई खोलने की सटीक आकार महत्वपूर्ण नहीं है. सुई आकार, इंजेक्शन के दबाव और इंजेक्शन समय की एक सीमा के भीतर के लिए सही मात्रा का एक सांस में उत्पादन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
Morpholinos एक प्रोटीन के भीतर डोमेन के कार्यात्मक विच्छेदन सहित कई अनुप्रयोगों, है. जब विशिष्ट एक्सॉन intron जंक्शनों लक्ष्य बनाया, morpholinos वहाँ से होने वाली splicing को रोकने जाएगा. हम दो morpholinos के प्रभाव की जांच की है कि बाँध एक्सॉन – intron HEG की mRNA पूर्व में जंक्शनों. morpholino heg_e3i3_egfr1 3 एक्सॉन और 3 intron के बीच जंक्शन बांध, परिपक्व टेप में एक्सॉन 3 शामिल से splicing मशीनरी को रोकने. morpholino heg_e4i4_egfr2 इसी तरह 4 एक्सॉन को निकालता है. दोनों exons 3 और 4 EGF की तरह दोहराता युक्त डोमेन सांकेतिक शब्दों में बदलना. कुछ भ्रूण heg_e4i4_egfr2 मामूली उत्परिवर्ती phenocopy इंजेक्शन के साथ, आगे के प्रयोगों के लिए हृदय विकास में एक्सॉन 4 HEG की भूमिका को समझने के लिए आवश्यक हो जाएगा. हैरानी की बात है, heg_e3i3_egfr1 साथ इंजेक्शन भ्रूण मस्तिष्क edema, सुविधा HEG म्यूटेंट में नहीं देखा है. यह morpholinos मातृ टेप है कि zygotic म्यूटेंट में अप्रभावित होगा बाँध की क्षमता के कारण हो सकता है.
हम Mably प्रयोगशाला और उनके तकनीकी सहायता के लिए Narie स्तोरेर के सदस्यों को स्वीकार करते हैं, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (NCRP वैज्ञानिक विकास अनुदान 0635363N) और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (अनुदान SCCOR RFA HL02-027) के वित्तपोषण के लिए.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
Micromanipulator | Tool | Narishige | MN 153 | |
Needle Puller | Tool | Sutter Instruments | P 97 | |
Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100 F6 | |
Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
Needle Holder | Tool | World Precision Instruments | MPH310 |