Denna video visar hur morpholino eller mRNA kan injiceras i zebrafisk embryon vid ett-cell steg för att minska eller öka specifik gen produkter under senare utveckling.
En av fördelarna med att studera zebrafisk är snabb och enkel att manipulera halter av protein i embryot. Morpholinos, som är syntetiska oligonukleotider med antisens komplementaritet att rikta RNA, kan läggas till embryot att minska uttrycket av en särskild gen produkt. Omvänt kan bearbetas mRNA läggas till i embryot att öka nivåerna av en gen produkt. Fordonet för att lägga till antingen mRNA eller morpholino att ett embryo är mikroinjektion. Mikroinjektion är effektiv och snabb, vilket möjliggör injektion av hundratals embryon per timme. Denna video visar alla steg som ingår i mikroinjektion. Kortfattat är ägg som samlats upp direkt efter utläggning och ställde upp mot ett objektglas i en petriskål. Nästa, en spetsig nål laddad med injektion material ansluten till en microinjector och en luft källa, och microinjector reglage justeras för att producera en önskvärd injektionsvolym. Slutligen är nålen störtade ner i embryots äggula och morpholino eller mRNA utvisas.
En av styrkorna i zebrafisk-modellen är den lätthet med vilken specifik gen produkter kan läggas till eller avlägsnas från embryot genom mikroinjektion. För att ubiquitously överuttrycker ett visst protein, det mRNA kodning sprutas in i äggulan vid 1-cell skede. Under embryots fortsatta utveckling, är RNA distribueras i hela organismen och översatt. Omvänt, för att eliminera ett visst protein, är morpholinos används. Morpholinos är syntetiska oligonukleotider utformade med antisens kompletterar specifika RNA. Liksom mRNA är morpholinos sprutas in i äggulan på 1-cell skede. Inne i embryot de binder sitt mål-RNA, förebygga översättning.
Den viktigaste ändringen som behöver göras för varje morpholino eller mRNA är koncentrationen av injicerade materialet. För hög koncentration av antingen morpholino eller mRNA kan orsaka icke-specifik toxicitet, medan varje morpholino måste testas empiriskt för att bestämma sin optimala koncentration, typiskt morpholino koncentrationer mellan 200 mikroM och 500 mikroM slå ner geners aktivitet effektivt utan att orsaka icke-specifika fel. Den exakta storleken på nålen öppningen är inte avgörande. Inom ett intervall på nål storlekar, insprutningstryck och injektion tid kan justeras för att producera en bolusdos av rätt volym.
Morpholinos har många tillämpningar, inklusive den funktionella dissekering av domäner i ett protein. När utformade för att rikta specifika exon-intron korsningar kommer morpholinos förhindra skarvning uppstår där. Vi har undersökt effekterna av två morpholinos som binder exon-intron korsningar i pre-mRNA i HEG. Den morpholino heg_e3i3_egfr1 binder korsningen mellan exon 3 och intron 3, hindrar splitsningsmaskineriet från att ha exon 3 till mogna avskrifter. Den morpholino heg_e4i4_egfr2 bort liknande exon 4. Både exoner 3 och 4 koda domäner som innehåller EGF-liknande upprepas. Några embryon injiceras med heg_e4i4_egfr2 måttligt phenocopy den muterade, ytterligare experiment kommer att krävas för att förstå vilken roll HEG exon 4 i hjärtat utveckling. Överraskande, embryon injiceras med heg_e3i3_egfr1 har hjärnödem, en funktion som inte syns i HEG mutanter. Detta kan bero på förmåga morpholinos att binda moderns avskrifter som skulle vara opåverkad hos zygotic mutanter.
Vi erkänner medlemmar av Mably labbet och Narie Storer för tekniskt bistånd och American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) och National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) för finansiering.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
Micromanipulator | Tool | Narishige | MN 153 | |
Needle Puller | Tool | Sutter Instruments | P 97 | |
Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100 F6 | |
Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
Needle Holder | Tool | World Precision Instruments | MPH310 |