Это видео показывает, как морфолино или мРНК может быть введен в данио эмбрионов на один-клеточной стадии для уменьшения или увеличения уровня специфических генных продуктов в течение последующего развития.
Одним из преимуществ изучения данио является простота и скорость манипуляции белка в зародыше. Morpholinos, которые синтетических олигонуклеотидов с антисмысловых комплементарности целевой РНК, могут быть добавлены в эмбрион сократить выражение того или иного продукта гена. С другой стороны, обрабатываются мРНК могут быть добавлены в эмбрион увеличить уровни генного продукта. Средство для добавления или мРНК или морфолино на эмбрион микроинъекции. Микроинъекция является эффективным и быстрым, позволяя инъекции сотен эмбрионов в час. Это видео показывает все этапы микроинъекции. Короче говоря, яйца собираются сразу после увольнения и выстроились против стекло микроскопа в чашке Петри. Далее, с острым концом иглы загружается с впрыском материала связано с microinjector и источником воздуха и microinjector управления настраиваются для получения желаемого объема инъекции. Наконец, игла погружается в желтке зародыша и морфолино или мРНК изгнаны.
Одной из сильных сторон модели системы данио является легкость, с которой определенные продукты генов могут быть добавлены или исключены из эмбриона путем микроинъекции. Чтобы повсеместно гиперэкспрессией частности белка, мРНК, кодирующей ее закачивают в желтке на 1-клеточной стадии. Во время последующего развития эмбриона, РНК, распространяется по всему организму и переводится. С другой стороны, для устранения того или иного белка, morpholinos используются. Morpholinos синтетические олигонуклеотиды разработан с антисмысловых взаимодополняемости конкретных РНК. Как мРНК, morpholinos вводят желток на 1-клеточной стадии. Внутри эмбриона они связывают свои РНК мишени, предотвращение перевода.
Основные изменения, которые необходимо сделать для каждого морфолино или мРНК концентрации вводимого материала. Слишком высокая концентрация либо морфолино или мРНК может вызвать неспецифические токсичности, в то время как каждый морфолино должно быть проверено эмпирически определить его оптимальную концентрацию, как правило, морфолино концентрациях от 200 мкМ и 500 мкМ сбить активность генов эффективно, не вызывая неспецифические дефекты. Точный размер иглы открытие не является решающим. В диапазоне размеров иглы, давление впрыска и время впрыска может быть отрегулирована для производства болюс правильный объем.
Morpholinos имеют много приложений, в том числе функциональной рассечение доменов в белке. Когда предназначены для решения конкретных экзон-интрон переходы, morpholinos будет препятствовать сращивания от происходящих в нем. Мы исследовали влияние двух morpholinos, которые связывают экзон-интрон переходов в пре-мРНК из хег. Морфолино heg_e3i3_egfr1 связывает стыке экзонов 3 и интрон 3, предотвращения сращивания машины от включения экзона 3 в зрелые транскриптов. Морфолино heg_e4i4_egfr2 так же удаляет экзон 4. Оба экзонов 3 и 4 кодировать доменов, содержащих ЭФР-подобных повторов. Некоторые эмбрионы вводят heg_e4i4_egfr2 умеренно фенокопии мутант, дальнейшие эксперименты будут необходимы для понимания роли HEG экзона 4 в развитии сердца. Удивительно, но эмбрионы вводят heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга, функция не видел в хег мутантов. Это может быть связано со способностью связывать morpholinos материнской стенограмм, которые будут затронуты в зиготических мутантов.
Мы признаем, члены Мабли лаборатории и Narie Сторера за техническую помощь, а также Американской ассоциации сердца (НКРЗ Ученый грантов на цели развития 0635363N) и Национальный институт сердца, легких и крови институт (грант SCCOR RFA HL02-027) для финансирования.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
Micromanipulator | Tool | Narishige | MN 153 | |
Needle Puller | Tool | Sutter Instruments | P 97 | |
Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100 F6 | |
Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
Needle Holder | Tool | World Precision Instruments | MPH310 |