Summary
وهناك طريقة بسيطة تسمح لاستخراج السريعة وتحليل الهرمونات النباتية متعددة من عينات الأنسجة الصغيرة. يستخدم الإجراء استخراج بخار المرحلة كخطوة تنقية الرسمي. ويتم تحليل العينات بواسطة أيونات + GC / MS مع التأين الكيميائية التي تنتج أساسا (M +1).
Abstract
الهرمونات النباتية والمركبات المتصلة يشير تلعب دورا هاما في تنظيم استجابات النبات للمحفزات البيئية المختلفة والضغوط. بين الضغوط الشديدة والحشرات بالأعشاب ، وعدوى للمرض ، والإجهاد الجفاف. لكل من هذه الضغوط مجموعة معينة من الهرمونات و / أو خليط منها ومن المعروف أن ردود صقل ، وبالتالي ضمان بقاء النبات. الهرمونات الرئيسية المشاركة في تنظيم هذه الردود هي حمض jasmonic (JA) ، وحمض الصفصاف (SA) ، وحمض الأبسيسيك (ABA). إلى فهم أفضل لدور الهرمونات الفردية ، وكذلك تفاعلها المحتملة خلال هذه الاستجابات من الضروري رصد التغيرات في وفرة في زمنية وكذلك بطريقة المكانية. لالكمي سهلة وحساسة واستنساخه من هذه الإشارات وغيرها من المركبات طورنا طريقة القائمة على استخراج مرحلة البخار واللوني للغاز / قياس الطيف الكتلي (GC / MS) التحليل (1 ، 2 ، 3 ، 4). بعد استخراج هذه المركبات من الأنسجة النباتية المائية الحمضية 1 - بروبانول مختلطة مع ثنائي كلورو ميثان حمض الكربوكسيلية هي المحتوية على مركبات ميثليته ، تتطاير تحت حرارة ، والتي تم جمعها على الماصة البوليمرية. بعد شطف إلى قارورة العينة يتم فصل analytes اللوني بواسطة الغاز والكشف عنها بواسطة التأين الكيميائي مطياف الكتلة. استخدام المعايير الداخلية المناسبة ثم يسمح لتقدير بسيط من المجالات المتعلقة ذروة قياسية الحليلة والداخلية.
Protocol
- أولا نحن في حاجة الى اعداد 2ml المسمار غطاء قنينة لاستخراج : إضافة 400ul العازلة استخراج (1 - بروبانول : H2O : حمض الهيدروكلوريك تتركز 2:1:0.002 المجلد / المجلد / المجلد) و 10 ميكرولتر من معيار الداخلية منها (10ng/μl ) إلى القارورة. التجميد في النيتروجين السائل ثم تضاف حبات السيراميك.
- إضافة المواد النباتية (بين 50 و 200mg) ، في حين لا تزال تتمركز في قنينة النيتروجين السائل. علما بأن وزن المواد النباتية واضاف لابد من مزيد من المعالجة قبل المقدرة للسماح في وقت لاحق لالكمي الدقيق ، الذي يقوم على أساس الوزن الطازج.
- تأكد من أن تبخرت كل النتروجين السائل قبل أن يغلق بإحكام القارورة مع قبعة. علما أن الحد الأقصى يجب أن يكون الختم المطاطي لمنع انسكاب المذيبات ، وبالتالي ، والمركبات المستخرجة خلال التجانس.
- تجانس النسيج في FastPrep أو Precellys الخالط طاحونة حبة بسرعة 6000 (لPrecellys) لمدة 30 ثانية.
- إزالة قارورة من الخالط بشكل فردي ، وفتح الغطاء بعناية وإضافة إلى ثنائي كلورو ميثان 1ml من كل عينة. إغلاق قنينات مرة أخرى بإحكام والتجانس مرة أخرى ل15sec - 10 الساعة 6000 (Precellys).
- نقل إلى أحد أجهزة الطرد المركزي قوارير منضدية وفصل المرحلة العضوية من المرحلة المائية في ل10.000xg 60sec.
- بعد الانفصال مرحلة تحويل الطبقة السفلى خضراء (المرحلة العضوية ، ويحتوي على هرمونات والمعايير الداخلية) من فرد إلى قنينة قنينة الزجاج 4ml نظيفة. تجنب نقل المياه (المرحلة العليا). بدلا من ذلك ، يمكن استخدام خلات الإيثيل بدلا من ثنائي كلورو ميثان. في هذه الحالة سوف تكون المرحلة ethyacetate الطبقة العلوية (أخضر) وأصبح الآن أكثر سهولة لإزالة ونقل إلى قارورة زجاجية 4ml الطازجة. كما كان من قبل ، وتجنب نقل المياه.
- ينفخون المذيب مع الهواء من خلال مشعب لحوالي 10-25 دقيقة (يعتمد على العينة) ؛ الاختيار مع طرف واحد إذا تدفق الهواء العينات الجافة (بدقة). لا عينات overdry ، قد تتسبب في خسائر لهذه المركبات.
- مرة واحدة تجفف العينات يمكن أن نبدأ من مثلأيشن الكربوكسيلية الحمضية التي تحتوي على المركبات في عينات لدينا. أولا ، يتم إضافة 100 ميكرولتر من خليط diethyether / الميثانول (09:01 المجلد / المجلد) إلى كل قنينة تليها 4μl حل trimethylsilyldiazomethane 2M (في الهكسان ، الدريتش سيغما). تغلق فورا مع غطاء قنينة المسمار مكشوفة مزودة الحاجز سيليكون تفلون مبطنة. يهز بلطف واحتضان على RT لمدة 25 إلى 30min.
- بعد الانتهاء من الخطوة 9 ، بدوره على كتلة التدفئة ودرجة الحرارة التي وضعت في جمع المطلوب. تقلب مركبات ميثليته يعتمد على حجمها ، ولكن أيضا على جماعات أخرى أكثر القطبية مثل O = ، - OH ، و- NH. لحامض الساليسيليك وjasmonic استرات الميثيل حمض جمع درجات الحرارة نحو 80 درجة مئوية تكفي ، بينما على سبيل المثال مركبات أخرى مثل الأحماض الدهنية C18 ، jasmonic تقارن حمض الأمينية ، coronatine و- 12 - أوكسو phytodienoic استر حمض الميثيل تتطلب درجات الحرارة بين 180-200 درجة مئوية لتطيير بفعالية.
- بعد حضانة 30min رد فعل مثلأيشن يحتاج إلى وقفه لتجنب رد فعل الثانوية غير المرغوب فيها. يتم ذلك عن طريق إضافة 4 ميكرولتر من الخل 2M حل الحمضية (في الهكسين) إلى كل قنينة. بعد إغلاق قنينات مع القبعات وvortexing قصيرة ، يسمح للعينات لاحتضان لمدة 30min.
- الفلاتر المستخدمة في استخراج هذه المرحلة بخار يتم يدويا وقدم في شكل غير متوفرة تجاريا. فهي تتألف من أنبوب تفلون الخارجي (حوالي 7 - 8cm طويلة) ، الى جانب واحد من الذي يتم إدخال أنبوب زجاجي جيدا المناسب من حوالي 4cm طول. على الجانب الآخر من الأنبوب التفلون يتم الضغط عيون القرص الصلب المقاوم للصدأ داخل الأنبوب حتى تصل إلى أنبوب زجاجي الداخلية وعلى أن حوالي 20 30mg من الممتزات (إما SuperQ 80/100 (توقف) أو HayeSep ® Q80/100) تضاف. يتم إدراج آخر شبكة القرص الصلب الذي لا يصدأ ، وأخيرا طرف الزجاج ويدفع في أنبوب التفلون ، وبالتالي الضغط بعناية شبكة القرص الصلب المقاوم للصدأ على ماصة. صورة مفصلة يظهر مرشح في الشكل 1.
الشكل 1. - خلال فترة الحضانة من 11 خطوة ، ومرشحات لجمع ميثليته ، وبالتالي ، والهرمونات النباتية المتقلبة ، لا بد من غسلها باستخدام 200ul الأول من الميثانول ، ثم يغسل 2 ثنائي كلورو ميثان مع 200ul لكل منهما. ثم ينفخ المذيبات المتبقية في مرشحات قبالة عن طريق الجو. ويمكن الآن أن تستخدم المرشحات لمحاصرة من الهرمونات المتقلبة من خلال عمليات استخراج مرحلة البخار.
- بعد 30min من الحضانة وقطع الحاجز المطاطي للقارورة قبعات 4ml مع مشرط. لجمع الهرمونات النباتية استخراج بخار المرحلة ترتبط المرشحات لتنظيف خطوط فراغ الفرد بمعدل تدفق نحو 800ml/min. ثم يتم إدراج المرشحات في قارورة من خلال خفض الحاجز. كما تم إدراج تلميح الماصة الصغيرة ليكون بمثابة مدخل الهواء. خلال هذا الجزء الأول من الإجراء قارورة مع إدراج المرشحات والتي ستعقدفي وضع مستقيم لتجنب أي من السائل داخل القارورة للحصول على اتصال مع طرف التصفية ، التي من شأنها تلويث الفلتر وبعد ذلك أيضا GC / MS. ثم يتم عقد قارورة باليد حتى يتم تبخر السائل عن طريق التصفية. ثم توضع في قوارير مع المرشحات يعلق على كتلة التدفئة والحرارة تبخرت المركبات التي تم جمعها ل3min. وصفت مكونات مبدأ النظام وكذلك الإعداد في الشكل 1. بعد هذه الخطوة استخراج بخار المرحلة النهائية توضع قارورة مع المرشحات لا تزال تعلق على الرف ، وسمح ليبرد.
- عندما وصلت مرشحات درجة حرارة الغرفة مرة أخرى وأنهم eluted مع 150ml من ثنائي كلورو ميثان إلى قارورة GC - 1.5 مل مزودة إدراج. تغيير تطاير المذيبات المتبقية من تصفية وتوج في قارورة وتحليلها بواسطة GC / MS.
واللوني للغاز مجهزة انقسام / حاقن splitless (وضع splitless 250 درجة مئوية ، وحجم الحقن 1μ) ينبغي أن تستخدم ربطه إلى مطياف الكتلة يعمل في وضع التأين الكيميائي (CI) للتحليل). يتم فصل المركبات على HP - 1MS العمود (30M خ خ 0.25mm 025μm) الذي عقد في 40 درجة مئوية لمدة 1min بعد الحقن ، ومن ثم درجة الحرارة المبرمجة في 15 درجة مئوية / دقيقة الى 250 درجة مئوية (ل10min) ، مع الهليوم باعتبارها الناقل الغاز (ثابت 0.7ml/min تدفق). لتحليل MS - تستند على حد سواء ، يمكن أن تستخدم quadropole (مثل اجيلنت HP5973) وايون فخ المستندة إلى مطياف الكتلة (مثل زحل فاريان 2200). كغاز CI إما الأيزوبيوتان (يأتي في خزانات الغاز) أو الميثانول (تستخدم أبخرة من خزان السائل) يمكن استخدامها ، ولكن ، ينبغي في كل حالة يتم فحص أجزاء من رد فعل التأين قبل ايون برامج مختارة (SIC) العد يتم إنشاؤها. وقد استخدمنا البرنامج التالي لنظام فاريان 3900/Saturn GC 2200 MS والميثانول والكاشف CI : 5.00 - 11.30min أيونات (M +1) + 153-158 (ميثيل الساليسيلات 153 ، الميثيل 2 H 5 - الساليسيلات) ؛ 11.30 - 13.30min أيونات (M +1) + 207-228 (ميثيل jasmonate 207 و 225 ، 209 و الميثيل dihydrojasmonate 227) ؛ 13.30 - 16.30min أيونات (M +1) + 237-300 (ميثيل حمض الأبسيسيك 261 ، 2 الميثيل وينبغي تحديد H - 6 حمض الأبسيسيك 267 (حمض الأبسيسيك تنتج في الغالب [2 O MH +1] + الأيونات) جميع المركبات من خلال المقارنة مع المعايير الحقيقية المتاحة تجاريا. الكمي ليتم JA ، SA ، وأبا عن طريق الربط بين منطقة الذروة (المستخرج الأيونات) مع منطقة الذروة (الأيونات المستخرجة) من معيار الداخلية منها ، ويستند أيضا على الوزن الطازج من المواد النباتية المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدم الأسلوب هنا ثبت للعمل بشكل صحيح لمجموعة واسعة من المركبات النباتية إشارة بشرط أن يكون حجم وطبيعة المواد الكيميائية للمركب لا يمنع من استخراج ، ميثليته ، وتبخيرها. أيضا ، فإن الإجراء مثيلة كما هو وصفها هنا ليست الطريقة الوحيدة لderivatization. ويمكن Silyllation أستلة من الطرق البديلة والبروتوكولات ويمكن العثور بسهولة على الانترنت.
إذا كان مطياف الكتلة ليست قادرة على رصد واحد ايون نطاق الشامل التي يتم تسجيلها خلال تشغيل ينبغي أن تكون محدودة لاستبعاد غير المرغوب فيها أيونات كثيرة جدا من هذه العملية. على سبيل المثال ، وحامض jasmonic (JA) ، وشعلته حمض ثنائي هيدرو الداخلية jasmonic (dhJA) تنتج الرئيسيتين (M +1) + الأيونات ، 207 و 225 لJA ، و 209 و 227 لdhJA خلال التأين الكيميائية مع الميثانول. لأن هذه الرئيسيتين (M +1) + الجماهير (207 و 225 لJA و 209 و 227 لdhJA) ليس لديهم نفس وفرة rationfor JA dhJA ، ينبغي أن تكون على حد سواء وتستخدم لاستخراج الكمي. ولذلك ، ينبغي تسجيل مجموعة الشامل 207-228 ، وينبغي استخلاص أيونات محددة في وقت لاحق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites. Plant Journal. 39, 790-808 (2004).
- Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. Airborne signals prime plants against insect herbivore attack. PNAS. 101, 1781-1785 (2004).
- Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O´, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants. PNAS. 100, 10552-10557 (2003).
- Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).
