Summary
Küçük doku örneklerinde birden fazla bitki hormonların hızlı çıkarma ve analiz için izin veren basit bir yöntem sağlanır. Bu prosedür, buhar faz ekstraksiyon ağırbaşlı arıtma adımı olarak kullanır. Örnekleri, GC / MS ile ağırlıklı olarak üretir kimyasal iyonizasyon (M 1) + iyonları tarafından analiz edilir.
Abstract
Bitki hormonları ve ilgili sinyalizasyon bileşikler, çeşitli çevresel uyaranlara ve gerilmeler bitki yanıtların düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. En şiddetli gerilmeler arasında, böcek herbivory, patojen enfeksiyon, ve kuraklık stresi. Bunların her biri, böylece bitki hayatta kalmasını bunların ince ayarını yanıtları bilinen belirli bir hormon seti ve / veya kombinasyonları, vurgular. Bu yanıtların düzenlenmesinde yer alan önemli hormonların Jasmonik asit (JA), salisilik asit (SA) ve absisik asit (ABA). , Bolluk içinde bir zamansal hem de mekansal bir moda değişiklikleri daha iyi izlemek için bireysel hormonların yanı sıra gerekli bu tepkiler sırasında potansiyel etkileşim rolünü anlamak için. Bu ve diğer sinyalizasyon bileşikler, kolay, hassas ve tekrarlanabilir ölçümü için buhar faz ekstraksiyonu ve gaz kromatografisi / kütle spektrometresi (GC / MS) analizi (1, 2, 3, 4) dayanan bir yöntem geliştirdi. 1-propanol, diklorometan ile karıştırıldığında asidik sulu bitki doku ayıkladıktan sonra bu bileşiklerin karboksilik asit içeren bileşikler, mavi, ısı altında volatilized ve polimerik emici üzerinde toplanır. Analitler bir örnek şişesine elüsyon sonra gaz kromatografisi ile ayrılır ve kimyasal iyonizasyon kütle spektrometresi tarafından algılanır. Analit ve internal standart pik alanları ile ilgili basit ölçümü için uygun iç standartlarının kullanımı sağlar.
Protocol
- Öncelikle ekstraksiyonu için 2 ml vidalı kapaklı şişeleri hazırlamak gerekir: 400ul ekstraksiyon tamponu ekle (1-propanol: H2O: konsantre HCl 2:1:0.002 hacim / hacim / hacim) ve ilgili iç standart 10 ul (10ng/μl ) bir flakon. Sıvı nitrojen içinde dondurun ve sonra seramik boncuklar ekleyin.
- (50 ve 200 mg arasında) bitki materyali şişeleri hala sıvı nitrojen içinde konumlandırılmış ekleyin. Katma bitki materyali ağırlığı daha fazla işlem taze ağırlığı dayalı tam sayısallaştırma, daha sonra izin önce tahmin gerektiğini unutmayın.
- Tüm sıvı azot flakon bir kapak ile sıkıca kapatmadan önce buharlaşmış olduğundan emin olun. Kap homojenizasyon sırasında solvent dökülmeleri ve böylece, ayıklanan bileşikler önlemek için kauçuk conta olması gerektiğini unutmayın.
- 30 sn için 6000 bir hızda (Precellys için) bir FastPrep veya Precellys boncuk değirmeni Homojenizatör doku homojenize.
- Şişeleri ayrı ayrı homojenizatör çıkarın, kapağı dikkatli bir şekilde açın ve her bir örnek için 1 ml diklorometan eklemek. Kapat şişeleri tekrar sıkıca ve 6000 (Precellys) 10-15sn için tekrar homojenize.
- Bir masaüstü santrifüj şişeleri transferi ve organik faz 60sec için 10.000xg sulu faz ayrı.
- Faz ayrıldıktan sonra temiz bir 4ml cam flakon şişeleri tek tek yeşil alt katman (organik faz, hormonlar ve iç standartları içerir) aktarın. Su transferi (üst faz) kaçının. Alternatif olarak, etil asetat, diklorometan yerine kullanılabilir. Bu durumda ethyacetate faz üst katmanı (yeşil) ve şimdi kaldırmak ve yeni bir 4ml cam flakon transfer daha kolay olacaktır. Daha önce olduğu gibi, su transferi kaçının.
- Yaklaşık 10-25 dakika (örnek bağlıdır) manifoldu ile hava ile solvent kapalı darbe; örnekler kuru (dikkatle) tek bir hava akımı ucu ile kontrol edin. Overdry örnekleri etmeyin, bu bileşiklerin kaybına neden olabilir.
- Örnekleri kurutulmuş sonra karboksilik metilasyon asit içeren örneklerde bileşikler başlayabilirsiniz. Birincisi, bir diethyether / metanol karışımı (09:01 hacim / hacim) 100 ul 2M trimethylsilyldiazomethane solüsyonu (hekzan, Sigma Aldrich) 4μl tarafından her flakon eklenir. Şişeler hemen Teflon kaplı silikon septum ile donatılmış bir üstü açık vidalı kapak ile kapatılır. Yavaşça çalkalayın ve 25 ila 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- 9. adımı tamamladıktan sonra, istenilen toplama sıcaklıkta ısıtma bloğu ve set açmak. Metillenmiş bileşiklerin volatilite, onların büyüklüğüne değil, aynı zamanda = O,-OH ve-NH gibi diğer, daha polar gruplar bağlıdır. Jasmonik asit ve salisilik asit metil ester bir koleksiyon sıcaklığı yaklaşık 80 ° C yeterli, oysa örneğin C18 yağ asitleri gibi diğer bileşikleri, Jasmonik asit amino asit konjugatları coronatine, ve 12-oxo-phytodienoic asit metil ester arasındaki sıcaklık gerektiren 180-200 ° C etkin bir şekilde gaz haline.
- 30 dakika inkübasyondan sonra metilasyon reaksiyonu istenmeyen ikincil reaksiyon önlemek için durdurulması gerekir. Bu her flakon 2M bir asetik asit-çözümü (hekzan) 4 ul ekleyerek yapılır. Kapaklar ve kısa bir vorteks şişeleri kapattıktan sonra, numuneler, başka bir 30 dakika boyunca inkübe izin verilir.
- Bu buhar faz ekstraksiyon için kullanılan filtreler, el yapımı ve ticari olarak sunulan formu mevcut değildir. Onlar bir taraftan 4cm hakkında uzunluğu iyi oturan bir cam tüpü içine bir dış teflon tüp (7-8cm uzunluğunda), oluşur. Diğer taraftan teflon tüp iç cam tüp ulaşıncaya dek bir paslanmaz çelik hasır disk tüp içine itilir üzerine yaklaşık 20-30mg adsorban (SuperQ 80/100 (üretilmiyor) veya HayeSep ® Q80/100 ya) eklenir. Başka bir paslanmaz çelik hasır disk takılı ve nihayet bir bardak ucu böylece dikkatle emici paslanmaz çelik hasır disk basarak, teflon tüp içine iter. Ayrıntılı bir resmi bir filtre, Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1. - Adım 11 inkübasyon süresi boyunca, filtreler, metil ve böylece, uçucu bitki hormonları toplanması için 200ul diklorometan her 2 yıkar sonra ilk 200ul metanol kullanarak yıkanacak, ve. Filtreler kalan Solvent sonra hava üflenir. Filtreler, buhar faz ekstraksiyon yoluyla uçucu hormonların yakalama için kullanılabilir.
- Inkübasyon 30 dakika sonra 4ml flakon kapaklar kauçuk kapaklı bir neşter ile kesilir. Temizlenmiş filtreler 800ml/min hakkında bir akış hızında bireysel vakum hatları bağlı buhar faz ekstraksiyon bitki hormonları toplamak için. Filtreleri sonra kesme septa ile şişenin içine yerleştirilir. Küçük bir pipetlemeyin ucu da bir hava girişi olarak hareket eklenir. Prosedürün bu ilk bölümü sırasında eklenen filtreler ile şişeleri yapılacakflakon içinde herhangi bir sıvı filtre ucu, filtre ve daha sonra da GC / MS kirletici ile temas almak önlemek için dik bir pozisyonda. Filtre ile tüm sıvı buharlaşıncaya kadar şişeleri sonra elle tutulur. Sonra ekli filtreleri ile şişeleri ısıtma bloğu ve 3dk için toplanan ısı buharlaşmış bileşikler üzerine yerleştirilir. Sisteminin yanı sıra kurulum temel bileşenler Şekil 1'de tasvir edilmektedir. Bu son buhar faz ekstraksiyon adımdan sonra hala bağlı filtreleri ile şişeleri rafa yerleştirilir ve soğuması için izin verilir.
- Filtreleri tekrar oda sıcaklığına ulaşmış, bir ekleme ile donatılmış bir 1,5 ml GC-flakon diklorometan 150ml ile yıkandı. Şişeleri kapatılmış ve GC / MS ile analiz filtre kalan solvent üfleme Alter.
Bölünmüş bir splitless enjektör / analizi için kullanılan kimyasal iyonizasyon modu (CI) işletilen bir kütle spektrometresi ile arayüzü (° C, enjeksiyon hacmi 1μ splitless modu 250)) ile donatılmış bir gaz kromatografisi. Bileşikler HP 1MS sütun ayrılmış (30m x 0.25mm x 025μm) 40 ° C enjeksiyondan sonra 1dk için düzenlenen ve daha sonra sıcaklık 15 programlanmış ° C / dak helyum ile 250 ° C (10dk), taşıyıcı olarak gaz (sabit akışı 0.7ml/min). MS-tabanlı analiz için iki Quadropole (örneğin Agilent HP5973) ve bir iyon tuzak tabanlı (örneğin Varian Satürn 2200) kütle spektrometresi olabilir. CI gaz ya izobütan (gaz tankları geliyor) veya metanol (bir sıvı rezervuar buharlar kullanılır) kullanımı gibi, ancak, her durumda iyonizasyon reaksiyon parçaları seçilen iyon sayısı (SIC) programları önce kontrol edilmelidir oluşturulur. Biz CI reaktif olarak Varian GC 3900/Saturn MS 2200 sistemi ve metanol için aşağıdaki programı kullanılır: 5.00-11.30min iyonları (M 1) + 153-158 (metil salisilat 153, metil 2 H 5-salisilat); 11.30-13.30min iyonları (M 1) + 207-228 (metil jasmonate 207 ve 225, metil dihydrojasmonate 209 ve 227); 13.30-16.30min iyonları (M 1) + 237-300 (metil absisik asit 261, metil 2 H 6-absisik asit 267 (absisik asit ağırlıklı olarak [MH 2 O 1] + iyonları). bileşikler otantik piyasada mevcut standartlar ile karşılaştırılması ile tespit edilmelidir. JA, SA, ve ABA Niceleme pik alanı ilişkilendirilerek yapılır ilgili internal standart pik alanı (çıkartılan iyonları) (iyonlar alınır) ve aynı zamanda kullanılan bitki materyali taze ağırlığı dayanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan yöntem, büyüklüğü ve kimyasal yapısı bileşik çıkarılan, yakacak ve buharlaşmış olan engellemez bitki sinyalizasyon bileşiklerin çok geniş bir dizi için güvenilir olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, burada açıklandığı gibi metilasyon prosedürü türevlendirme tek yolu değildir. Silyllation ve asetilasyon alternatif yöntemler ve protokoller kolayca online olarak bulunabilir.
Kütle spektrometresi tek iyon sürecinden çok fazla sayıda istenmeyen iyonları dışlamak için bir çalışma sırasında kaydedilen sınırlı olmalıdır kütle aralığı izleme yeteneğine sahip değildir. Örneğin, iki büyük (M 1) + iyonları, JA için 207 ve 225 ve 209 ve metanol ile kimyasal iyonizasyon sırasında dhJA 227 Jasmonik asit (JA) ve kendi iç standart dihidro Jasmonik asit (dhJA) üretir. Bu iki büyük (M 1) + kitleler (JA için 207 ve 225, 209 ve dhJA 227) Çünkü aynı bolluk rationfor JA ve dhJA zorunda değilsiniz, her ikisi de ayıklanır ve miktar tayini için kullanılan olmalıdır. Bu nedenle, bir kütle aralığı 207 ile 228 kaydedilmiş olmalı ve belirli iyonları daha sonra çıkarılan olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites. Plant Journal. 39, 790-808 (2004).
- Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. Airborne signals prime plants against insect herbivore attack. PNAS. 101, 1781-1785 (2004).
- Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O´, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants. PNAS. 100, 10552-10557 (2003).
- Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).
