Summary
간단한 방법이 작은 조직 샘플에서 여러 식물 호르몬의 급격한 추출 및 분석을위한 허용 제공됩니다. 절차는 엄숙한 정화 단계로 증기 위상 추출을 사용합니다. 샘플은 GC / 주로 생산하는 화학 이온화 (M +1)과 MS + 이온에 의해 분석됩니다.
Abstract
식물 호르몬 및 관련 신호 화합물은 다양한 환경 자극과 스트레스에 식물 반응의 조절에 중요한 역할을한다. 가장 심각한 스트레스 중 곤충 herbivory, 병원체 감염과 가뭄 스트레스 있습니다. 이러한 각함으로써 식물의 생존을 보장 그것의 조정 반응하는 것으로 알려져 있습니다 특정 호르몬의 설정 및 / 또는 조합을 강조하십시오. 이러한 반응의 규정에 관련된 주요 호르몬은 jasmonic 산성 (JA), 살리실산 (SA), 그리고 아브 산성 (ABA)입니다. 더 시간적뿐만 아니라 공간적 패션 그들의 풍부한 변화를 모니터링하는 개인 호르몬뿐만 아니라 그것이 필요합니다 이러한 반응 중에 잠재적인 상호 작용의 역할을 이해한다. 이러한 다른 신호 화합물의 쉬운 민감한 및 재현성 부량 위해 우리는 증기 위상 추출 및 가스 크로마 토그래피 / 질량 분석계 (GC / MS) 분석 (1, 2, 3, 4)에 따라 방법을 개발했습니다. 산성 수성하여 식물 조직에서 이러한 화합물을 추출 후 1 프로파놀는 dichloromethane와 혼합 카르복실산 함유 화합물은, methylated 열 아래 volatilized 및 고분자 흡착제에서 수집하고 있습니다. 샘플 약병에 용출 후 analytes는 가스 크로마 토그래피로 구분되며 화학적 이온화 질량 분광법에 의해 감지. 적절한 내부 표준의 사용은 다음 analyte 및 내부 표준의 최대 영역을 관련된하여 간단한 부량 수 있도록합니다.
Protocol
- 처음에 우리는 추출을위한 2ml 나사 캡 튜브를 준비해야합니다 400ul 추출 버퍼를 추가 (1 - 프로파놀 : H2O : 집중 HCL 2:1:0.002 권 / 권 / 권) 및 해당 내부 표준 10 μl가 (10ng/μl ) 유리병 수 있습니다. 액체 질소로 동결 후 세라믹 비즈를 추가합니다.
- 유리병 여전히 액체 질소에 배치하는 동안 (50 200mg 사이) 식물을 추가합니다. 추가 식물의 무게 추가 처리가 신선한 무게를 기반으로 정확한 부량, 나중에 허용하기 전에 예상되어야합니다.
- 모든 액체 질소가 단단히 마개로 병을를 닫기 전에 증발되어 있는지 확인합니다. 뚜껑이 균질 동안 따라서 용제의 유출하고, 추출한 화합물을 방지하기 위해 고무 도장이 있어야합니다.
- 30 초에 대한 6000의 속도 (Precellys 용)에서 FastPrep 또는 Precellys 비드 분쇄기의 균질 화기의 조직을 균질.
- 개별적으로 균질 화기에서 튜브를 제거 조심스럽게 뚜껑을 열고 각 샘플에 dichloromethane의 1ml를 추가합니다. 닫기 튜브 다시 단단히하고 6000 (Precellys) 10 - 15sec에 다시 균질.
- 테이블탑 원심 분리기에 튜브를 전송하고 60sec에 대한 10.000xg에있는 수성 단계에서 유기농 단계를 구분한다.
- 상 분리 후 깨끗한 4ml 유리관으로 개별 튜브에서 로우어 그린 레이어 (유기 위상, 호르몬 및 내부 표준을 포함)을 전송합니다. 물의 양도 (상위 단계)를 피하십시오. 또는 에틸 아세테이트 대신 dichloromethane에 사용할 수 있습니다. 이 경우에는 ethyacetate 단계는 상위 레이어 (녹색)하고 지금은 제거하고 신선한 4ml 유리관으로 전달하는 것이 더 쉽습니다 것입니다. 이전처럼, 물의 이동을하지 마십시오.
- 10-25 분 (샘플에 따라)에 대한 다기관을 통해 공기와 용매를 날려, 샘플이 건조하는 경우 (주의) 한 공기 끝에 문의하십시오. overdry 샘플은하지 마세요,이에 대한 화합물의 손실을 발생할 수 있습니다.
- 샘플 건조되면 우리는 carboxylic의 methylation 산성 함유하는 시료의 성분을 시작할 수 있습니다. 첫째, diethyether / 메탄올 혼합 (9시 1분 권 / 권) 100 μl은 2M trimethylsilyldiazomethane 솔루션 (헥산, 시그마 알드리치 년)의 4μl 다음 각 유리병에 추가됩니다. 튜브는 즉시 테플론 늘어선 실리콘 심장 장착되어 오픈 상단 나사 마개로 닫혀 있습니다. 부드럽게 흔들 25 30 분에 대한 RT에서 알을 품다.
- 9 단계를 마친 후, 원하는 컬렉션 온도에서 가열 블록 설정하고 전원을 켜십시오. methylated 화합물의 휘발성들은 크기뿐만 아니라 = O, - OH, NH 및 같은 다른 더 북극 그룹에 따라 달라집니다. jasmonic 산성과 살리실산의 메틸 에스테르의 회수 온도 80 주변 ° C 충분, 반면에 예를 들어 C18 지방산과 같은 다른 화합물, jasmonic 산성 - 아미노산 conjugates, coronatine, 12 - 옥소 - phytodienoic 산성 메틸 에스테르 사이 온도를 필요로 180-200 ° C 효과적으로 휘발 수 있습니다.
- 30 분 부화 후 methylation 반응은 원치 않는 보조 반응을 피하기 위해 중단해야합니다. 이것은 각 유리병에 2M 초산 - 솔루션 (헥산)을 4 μl를 추가하여 이루어집니다. 모자와 짧은 vortexing으로 튜브를 닫은 후, 샘플은 다른 30 분 대한 부화 사용할 수 있습니다.
- 이 증기 위상 추출에 사용되는 필터는 수작업과 제시 형태로 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그들은 한쪽에서 4cm 길이에 대해 잘 맞는 유리 튜브가 삽입되는에 외부 테플론 튜브 (7~8센티미터 길이 약)로 이루어져 있습니다. 그것이 내부 유리관에 도달하고 때까지 테플론 튜브의 반대쪽에있는 스테인레스 스틸 메쉬 디스크가 튜브 안으로 밀려는 것을에 약 20 - 30mg 흡착제 (SuperQ 100분의 80 (단종) 또는 HayeSep ® Q80/100 중) 추가됩니다. 다른 스테인레스 스틸 메쉬 디스크가 삽입되고 마지막으로 유리 팁되므로 신중하게 흡수에 스테인리스 메쉬 디스크를 누르면, 테플론 튜브로 못살게 굴지입니다. 자세한 사진은 필터는 그림 1에 표시됩니다.
그림 1. - 11 단계의 배양 시간 동안 따라서 methylated하고, 휘발성 식물 호르몬의 수집에 대한 필터, 200ul의 dichloromethane 각 2 세척 후 메탄올의 첫 200ul를 사용하여 세탁해야합니다. 필터에 남아있는 용매는 다음 공기 날리게됩니다. 필터는 현재 기상 위상 추출을 통해 휘발성 호르몬의 트래핑에 사용될 수 있습니다.
- 부화 후 30 분 4ml 유리 뚜껑의 고무 septa은 메스로 절단됩니다. 청소 필터가 800ml/min 약 흐름 속도로 개별 진공 라인에 연결되어있는 증기 위상 추출하여 식물 호르몬을 수집합니다. 필터는 다음 컷 septa 통해 유리병에 삽입됩니다. 작은 pipet 팁 또한 공기 유입구의 역할을 삽입됩니다. 절차의 초기 부분에서 삽입 필터와 튜브 개최해야후 필터와 또한 GC / MS를 오염시킬 필터 팁, 연락하려 유리병 내부의 액체 중 하나를 피하기 위해 직립 위치에있다. 모든 액체가 필터를 통해 증발 때까지 튜브 그런 다음 수동으로 개최하고 있습니다. 다음 첨부된 필터와 튜브는 가열 블록 및 3min에 대한 수집 열 증발 화합물에 표시됩니다. 시스템뿐만 아니라 설치의 주요 구성 요소는 그림 1에 묘사된 있습니다. 이 마지막 증기 위상 추출 단계 후에도 부착된 필터와 튜브는 랙에 위치하고 진정 사용할 수 있습니다.
- 필터 다시 실내 온도에 도달하면 그들은 삽입과 함께 장착되어 1.5 ML의 GC - 약병에 dichloromethane의 150ml로 eluted 있습니다. 유리병이 뒤덮힌 및 GC / MS로 분석하는 필터에서 남은 용매를 날려 변경할 수 있습니다.
분할 / splitless 인젝터 화학 이온화 모드 (CI)에 운영하는 질량 분석기로 인터페이스 분석을 위해 사용해야합니다 (° C, 사출 볼륨 1μ이 splitless 모드 250))가 장착된 가스 크로마토 그래프. 화합물이 (30m X 0.25mm X 025μm) HP - 1MS 칼럼에서 분리 ° C 주사 후 1min 40에서 개최하고 온도가 15 프로그램되어 ° 헬륨과 함께 250 ° C (10 분)을,에 C / 분 캐리어로 가스 (일정한 흐름 0.7ml/min). MS 기반의 분석을위한 모두,이 quadropole (예 : 애질런트 HP5973)와 이온 트랩 기반 (예 : 베리안 토성 2200) 질량 분석계를 사용할 수 있습니다. CI 가스 중 이소 부탄 (가스 탱크에 제공) 또는 메탄올은 (액체 저수지의 증기를 사용하는)를 사용할 수 있듯이, 그러나 각각의 경우에 이온화 반응의 조각이 선택한 이온 개수 (SIC) 프로그램하기 전에 확인하여야한다 만들어집니다. 우리는 CI의 시약으로 베리안 GC 3900/Saturn MS 2200 시스템과 메탄올에 대한 다음과 같은 프로그램을 사용했을 : 5.00 - 11.30min 이온 (M +1) + 153-158 (메틸 살리실산 153, 메틸 2 H 5 살리실산을); 11.30 - 13.30min 이온 (M +1) + 207-228 (메틸 jasmonate 207과 225, 메틸 dihydrojasmonate 209 및 227), 13.30 - 16.30min 이온 (M +1) + 237-300 (메틸 아브 산 261, 메틸이 H 6 - 아브 산 267 (압시 신산은 주로 [MH 2 O 1] + 이온을 생산하고). 모든 화합물은 본격적인 상용 표준과 비교하여 확인한다. JA, SA 및 ABA의 부량가 정상 영역을 연관하여 이루어집니다 각 내부 표준의 최대 면적 (추출 이온)와 (은 이온을 추출) 또한 사용되는 식물 재료의 신선한 무게에 따라 달라집니다.
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Discussion
방법은 크기와 화합물의 화학적 특성이 추출 methylated, 그리고 증발되지 않도록하지 않습니다 제공하는 식물 신호 화합물의 다양한위한 안정적으로 작동하도록 입증되었습니다 여기를 발표했다. 또한, 그것이 본 설명으로 methylation 절차는 derivatization의 유일한 방법은 아니다. Silyllation 및 아세틸화 대체 방법과 프로토콜을하는 것은 쉽게 온라인으로 찾을 수 있습니다.
질량 분석계는 과정에서 너무 많은 불필요한 이온을 제외하도록 실행하는 동안 기록됩니다 제한해야하는 대량 범위를 모니터링 단일 이온이 가능하지 않은 경우. 예를 들어, jasmonic 산성 (JA)과 내부 표준 dihydro jasmonic 산성 (dhJA)는 크게 두 (M +1) + 이온, 207과 225 JA, 그리고 209과 메탄올과 화학 이온화 동안 dhJA에 대한 227을 생산합니다. 이 두 주요 (M +1) + 대중이 (207과 225에 대한 JA, 209 및 dhJA을위한 227) 때문에 같은 풍부한 rationfor JA와 dhJA를 갖고 있지 않다면, 그들은 모두 추출 및 부량 사용해야합니다. 따라서, 207에서 228로 대량 범위는 기록되어야하며 특정 이온은 나중에 추출해야합니다.
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References
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