Summary
提供一个简单的方法是，允许小组织样本的多种植物激素的快速提取和分析。该程序使用气相萃取庄严的纯化步骤。 GC / MS化学电离主要生产（M +1）+离子的样品进行了分析。
Abstract
在植物响应各种环境刺激和压力调节植物激素和相关的信令化合物发挥了重要作用。其中最严重的应力是昆虫的取食，病原体的感染，干旱胁迫。对于其中的每一个讲一套特定的激素和/或组合被称为微调的反应，从而保证植物的生存。在这些反应的调控涉及的主要激素是茉莉酸（JA），水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）。为了更好地理解个人激素的作用以及他们潜在的相互作用在这些反应，这是必要的，在一个时间以及空间的方式来监测其丰度的变化。对于这些和其他信号的化合物容易，灵敏度高，重现性好量化，我们开发了基于汽相萃取和气相色谱/质谱（GC / MS）分析（1，2，3，4）的方法。这些化合物从植物组织中提取的酸性水溶液后，1 - 丙醇与二氯甲烷混合羧酸化合物的甲基化，高温下挥发，在高分子吸水收集。后成样品瓶洗脱分析物是通过气相色谱分离和化学电离质谱检测。然后使用适当的内部标准，允许有关分析物和内标峰面积的简单量化。
Protocol
- 首先，我们需要准备提取2毫升螺丝帽小瓶：加入400ul提取缓冲液（1 - 丙醇：水：浓盐酸2:1:0.002卷/体积/体积）和10μL各自的内部标准（10ng/μl ）一小瓶。在液氮中冷冻，然后添加的陶瓷珠。
- 添加植物材料（50至200毫克），而小瓶仍然定位在液氮。需要注意的是要估计的进一步处理之前，以便精确量化，这是基于对鲜重后，添加植物材料的重量。
- 确保所有的液氮蒸发前紧紧地关闭第小瓶。请注意，上限需要有橡胶密封，以防止泄漏的溶剂，因此，提取的化合物，在同质化。
- 均匀FastPrep或Precellys珠粉碎机匀浆在6000速度（Precellys）在30秒的组织。
- 从匀浆小瓶单独删除，小心地打开瓶盖，添加二氯甲烷1ml到每一个样本。关闭小瓶再次紧密，均质15秒10再次在6000（Precellys）。
- 瓶转移到桌面离心机和10.000xg为60秒的水相有机相分开。
- 相分离后，转移个人小瓶绿色较低层（有机相，含有激素和内部标准）4毫升一个干净的玻璃小瓶。避免调水（上相）。此外，醋酸乙酯，二氯甲烷可以用来代替。在这种情况下ethyacetate阶段将上层（绿色），现在更容易去除，并转移到一个新鲜4毫升的玻璃小瓶。如前所述，避免调水。
- 吹掉溶剂与空气通过多方面的，约10-25分钟（取决于对样本）;检查与一个单一的气流提示，如果样品是干燥的（小心）。不要overdry样本，这可能会导致损失的化合物。
- 样品干燥后，我们就可以开始我们的样品中含有的化合物的羧基甲基酸。首先，100μL一个diethyether /甲醇混合液（9:1体积/体积）被添加到一个2M trimethylsilyldiazomethane的解决方案（正己烷，西格玛Aldrich公司）4μl每一瓶。样品瓶与聚四氟乙烯内衬硅胶隔一个开放的顶部的螺丝盖，立即关闭。轻轻摇动，并在室温下孵育25至30分钟。
- 第9步完成后，打开一个加热块，并设置所需的收集温度。甲基化合物的波动，取决于它们的大小，同时也对其他的，更极像= O - OH和- NH组。对于茉莉酸和水杨酸甲酯的集合温度约80 ° C是足够的，而其他化合物和C18的脂肪酸一样，茉莉酸，氨基酸的结合物，冠毒素，12 - 羰基phytodienoic酸甲酯例如需要温度之间180-200 ° C至有效挥发。
- 经过30分钟孵化甲基化反应需要停止，以避免不必要的二次反应。这是通过加入4μL一个2M的醋酸溶液（正己烷），每一瓶。帽和短期震荡后关闭的小瓶，样品孵育另一个30分钟。
- 这气相提取使用的过滤器都是手工制作，并在另一种形式提出市售。它们由一个外部的聚四氟乙烯管（约7 - 8CM长），合身的长度约4cm的玻璃管插入到这从一个侧面。在另一侧的聚四氟乙烯管，不锈钢丝网光盘压管内，直到它到达内玻璃管上，约20 - 30毫克的吸附剂（无论是80/100的super（已停产）或HayeSep ® Q80/100）添加。另一个不锈钢丝网光盘插入最后一个玻璃尖推入聚四氟乙烯管，从而仔细按吸收剂不锈钢丝网光盘。详细的图片过滤器如图1所示。
图1。 - 在第11步的孵化时间，过滤器收集的甲基化，因此，植物激素的波动，有使用甲醇的第一200ul洗涤，然后与每个200ul二氯甲烷洗涤。溶剂过滤器余下的是由空气吹走。该过滤器现在可以用于通过气相提取的挥发性激素诱捕。
- 4毫升样品瓶盖的橡胶隔孵育30min后用手术刀切开。气相提取的清洁过滤器连接到个人的流速约800ml/min真空线来收集的植物激素。该过滤器，然后插入小瓶通过削减隔。一个小吸管尖也插入作为一个进气口。在这个过程的初始一部分，与插入过滤器的小瓶举行在直立位置，里面的小瓶液体，以避免任何接触过滤嘴，这将污染的过滤器，并随后的GC / MS。小瓶，然后用手举行，直到所有的液体蒸发是通过过滤器。然后附上的过滤器的小瓶放在加热块和热蒸发的化合物为3分钟收集。如图1所示的系统以及设置的原则组件。这最后的气相提取步骤后仍然附着在过滤器的小瓶放置在机架上，并让其冷却下来。
- 当过滤器再次达到室温150毫升二氯甲烷洗脱到1.5毫升的装有插入GC小瓶。改变从小瓶加盖并用GC / MS分析的过滤器吹出来的剩余的溶剂。
气相色谱仪配备分流/不分流进样器（分流模式250℃，进样量为1μ）连接到一台质谱仪，在化学电离模式（CI）的经营应当用于分析）。 HP - 1MS列化合物是分开的（30米x0.25毫米x025μm）在40℃，注射1分钟后举行，然后温度在15编程° C /分钟至250℃（10分钟）用氦气，为载体气体（恒定流速0.7ml/min）。对于基于MS的分析，一个quadropole（如安捷伦HP5973）和离子阱（如瓦里安土星2200）质谱仪可以使用。作为一个CI气体要么异丁烷气罐或甲醇（水库从液体的蒸气用于）可使用，但是，在每种情况下的电离反应的碎片应检查前的选择离子数（SIC）的计划创建。我们用下面的程序：在Varian GC 3900/Saturn的MS 2200系统和甲醇作为CI试剂5.00 - 11.30min离子（M +1）+ 153-158（153水杨酸甲酯，甲基2 H 5 -水杨酸）; 11.30 - 13.30min离子（M +1）+ 207-228（茉莉酸甲酯，甲基二氢茉莉酮209 207和225和227）; 13.30 - 16.30min离子（M +1）+ 237-300（甲基脱落酸，甲基2 261 H 6脱落酸267（脱落酸产生主要是[M + H 2 O +1] +离子），所有的化合物，应确定与地道的市售标准比较。JA，SA和ABA是由相互关联的峰面积进行定量（提取离子）与各自的内部标准的峰面积（提取离子）的使用植物材料的鲜重的基础上。
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Discussion
这里介绍的方法已被证明了植物信号的大小和被提取，甲基化，而蒸发的化合物的化学性质并不妨碍它的化合物广泛可靠的工作。此外，甲基化过程，因为它是本文所述，是不是衍生化的唯一途径。 Silyllation和乙酰化的替代方法和协议，可以很容易地在网上找到。
如果不能够监测记录在运行过程中应仅限于从过程中排除太多不必要的离子质量范围内的单离子质谱仪。例如，茉莉酸（JA）和其内部的标准二氢茉莉酸（dhJA）产 生两个主要（M +1）+离子，司法机构政务长，207和225，209和227 dhJA用甲醇在化学电离。由于这两个主要（M +1）+群众（207和225为司法机构政务长; 209 dhJA 227）没有相同的丰度rationfor JA和dhJA，他们都应该被提取和量化。因此，质量范围从207到228应予以记录，并应提取后的具体离子。
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References
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