Überwachung Pflanzenhormone bei Stress Responses

Summary

Eine einfache Methode ist vorgesehen, dass ermöglicht eine schnelle Extraktion und Analyse von mehreren pflanzlichen Hormonen aus kleinen Gewebeproben. Das Verfahren nutzt Dampf-Flüssig-Extraktion als die feierliche Reinigungsschritt. Die Proben werden mittels GC / MS mit chemischer Ionisation, die vor allem produziert (M +1) +-Ionen analysiert.

Abstract

Pflanzenhormone und damit verbundene Signal-Verbindungen spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der pflanzlichen Reaktion auf verschiedene Reize aus der Umwelt und betont. Unter den härtesten Beanspruchungen Raupenfraß, Pathogeninfektion und Trockenstress. Für jede dieser Belastungen einer bestimmten Gruppe von Hormonen und / oder Kombinationen davon sind für die Feinabstimmung der Antworten genannt, wodurch die Pflanze das Überleben. Die wichtigsten Hormone bei der Regulation dieser Reaktionen beteiligt sind, Jasmonsäure (JA), Salicylsäure (SA) und Abscisinsäure (ABA). Zum besseren Verständnis der Rolle der einzelnen Hormone sowie deren mögliche Wechselwirkungen während dieser Reaktionen ist es notwendig, auf Veränderungen in ihrer Fülle in einem zeitlichen als auch in einer räumlichen Mode zu überwachen. Für die einfache, empfindliche und reproduzierbare Quantifizierung dieser und anderer Signalstoffe wir eine Methode entwickelt, auf Dampf-Flüssig-Extraktion und Gaschromatographie / Massenspektrometrie (GC / MS)-Analyse (1, 2, 3, 4). Nach dem Extrahieren dieser Verbindungen aus dem Pflanzengewebe durch saure wässrige 1-propanol mit Dichlormethan versetzt die Carbonsäure-haltige Verbindungen methyliert sind, verflüchtigt unter Hitze, und auf einem polymeren saugfähig. Nach der Elution in ein Probenfläschchen die Analyten durch Gas-Chromatographie getrennt und detektiert die durch chemische Ionisation-Massenspektrometrie. Der Einsatz von geeigneten internen Standards ermöglicht dann die einfache Quantifizierung über die Peakflächen von Analyt und interner Standard.

Protocol

1. Zunächst müssen wir die 2ml Schraubverschluss Fläschchen für die Extraktion vorbereitet: In 400ul Extraktionspuffer (1-propanol: H2O: konzentrierter HCl 2:1:0.002 vol / vol / vol) und 10 ul der jeweiligen internen Standards (10ng/μl ) in eine Durchstechflasche. Einfrieren in flüssigem Stickstoff und fügen Sie dann die Keramik-Perlen.
2. Fügen Sie das Pflanzenmaterial (zwischen 50 und 200 mg), während die Fläschchen noch in den flüssigen Stickstoff angeordnet sind. Beachten Sie, dass das Gewicht des zugegebenen Pflanzenmaterial zu schätzen vor der weiteren Verarbeitung später erlauben, für eine exakte Quantifizierung, die auf das Frischgewicht beruht hat.
3. Stellen Sie sicher, dass alle flüssigen Stickstoff vor dicht schließende das Fläschchen mit einer Kappe verdampft. Beachten Sie, dass die Kappe eine Gummidichtung, um Freisetzungen von Lösungsmitteln und somit extrahierten Verbindungen während der Homogenisierung zu verhindern muss.
4. Homogenisieren des Gewebes in einem FastPrep oder Precellys bead grinder Homogenisator mit einer Geschwindigkeit von 6000 (für Precellys) für 30 sec.
5. Entfernen Röhrchen aus Homogenisator individuell, öffnen Sie vorsichtig die Kappe und 1ml von Dichlormethan zu jeder Probe. Close Fläschchen wieder dicht und erneut homogenisieren für 10-15sec bei 6000 (Precellys).
6. Transfer-Fläschchen zu einer Tischzentrifuge und trennen Sie die organische Phase von der wässrigen Phase bei 10.000xg für 60sec.
7. Nach Phasentrennung Übertragung der untere grüne Schicht (organische Phase enthält die Hormone und die internen Standards) von einzelnen Flaschen, um eine saubere 4ml Glasfläschchen. Vermeiden Sie den Transfer von Wasser (obere Phase). Alternativ können Ethylacetat anstelle von Dichlormethan verwendet werden. In diesem Fall wird die ethyacetate Phase wird die obere Schicht (grün) und ist nun leichter zu entfernen und in ein frisches 4ml Glasfläschchen. Nach wie vor vermeiden die Übertragung von Wasser.
8. Blow off des Lösungsmittels mit Luft durch einen Verteiler für ca. 10-25 min (je nach Probe); erkundigen Sie sich bei einem Luftstrom Spitze, wenn die Proben trocken sind (vorsichtig). Nicht übertrocknen Proben, könnte aus diesem Grund in Höhe von Verbindungen.
9. Nachdem die Proben getrocknet sind, können wir beginnen die Methylierung der Carbonsäure-haltige Verbindungen in unseren Proben. Zunächst werden 100 ul einer diethyether / Methanol-Gemisch (9:1 vol / vol) in jedes Fläschchen von 4μl einer 2M Trimethylsilyldiazomethan Lösung (in Hexan, Sigma Aldrich) zugegeben. Vials werden sofort mit einem Open-Air-Schraubverschluss mit einem Teflon-ausgekleideten Silikonseptum ausgestattet geschlossen. Vorsichtig schütteln und bei RT für 25 bis 30min.
10. Nach Abschluss der Stufe 9, auf einem Heizblock und setzen wiederum auf die gewünschte Temperatur Sammlung. Die Volatilität des methylierten Verbindungen hängt von ihrer Größe, sondern auch auf andere, polare Gruppen wie = O,-OH und-NH. Für Jasmonsäure und Salicylsäure-Methylester eine Sammlung Temperaturen um 80 ° C ausreichend, wohingegen beispielsweise andere Verbindungen wie C18-Fettsäuren, Jasmonsäure-Aminosäure-Konjugate, Coronatin und 12-oxo-phytodienoic säuremethylester erfordern Temperatur zwischen 180-200 ° C, um effektiv zu verflüchtigen.
11. Nach 30min Inkubation der Methylierungsreaktion muss gestoppt, um unerwünschte Nebenreaktion zu vermeiden. Dies wird durch Zugabe von 4 ul einer 2 M Essigsäure-Lösung (in Hexan) in jedes Fläschchen getan. Nach dem Schließen der Röhrchen mit Kappen und einen kurzen Vortexen werden die Proben dürfen für eine weitere 30min inkubiert.
12. Die Filter für diese Dampfphase Extraktion verwendet werden handgefertigt und in der vorgestellten Form nicht im Handel erhältlich. Sie bestehen aus einer äußeren Teflonschlauch (ca. 7-8cm lang), in die von der einen Seite eine gut sitzende Glasrohr von ca. 4cm Länge eingelegt ist. Auf der anderen Seite der Teflonschlauch ein Edelstahlgewebe Scheibe ist in der Röhre geschoben, bis es das innere Glasrohr erreicht und auf die über 20-30mg Adsorbens (entweder SuperQ 80/100 (abgebrochen) oder HayeSep ® Q80/100) hinzugefügt werden. Ein weiterer Edelstahlgewebe Disc eingelegt ist und schließlich ein Glas von Spitze wird in den Teflonschlauch schiebt, damit vorsichtiges Drücken der Edelstahlgewebe Disc auf dem saugfähigen. Ein detailliertes Bild eines Filters ist in Abbildung 1 dargestellt.
    
    Abbildung 1.
13. Während der Inkubationszeit von Schritt 11, müssen die Filter für die Sammlung des methylierten und somit volatile Pflanzenhormone, gewaschen mit ersten 200 &mgr; l Methanol und dann 2 Wäschen mit 200 &mgr; l Dichlormethan. Solvent übrigen in die Filter wird dann durch Luft geblasen. Die Filter können nun für das Auffangen flüchtiger Hormone durch Dampf-Flüssig-Extraktion verwendet werden.
14. Nach 30min Inkubation der Gummisepta der 4ml Fläschchen Kappen sind mit einem Skalpell ausgeschnitten. Um die Pflanzenhormone von Dampf-Flüssig-Extraktion der gereinigten Filtern auf einzelne Vakuumleitungen bei einer Flussrate von ca. 800ml/min verbunden sind zu sammeln. Die Filter werden dann in das Fläschchen durch den Schnitt Septen eingefügt. Eine kleine Pipettenspitze wird auch eingesetzt, um als Lufteinlass handeln. Während dieser ersten Teil des Verfahrens, die Fläschchen mit den eingesetzten Filter müssen gehalten werdenin eine aufrechte Position zu einem der Flüssigkeit im Inneren der Flasche zu vermeiden, in Kontakt mit dem Filter Spitze, die den Filter und anschließend auch die GC / MS verunreinigen bekommen würde. Die Fläschchen werden dann von Hand gehalten, bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter verdampft wird. Dann werden die Flaschen mit den beiliegenden Filter sind auf dem Heizblock und Wärme verdampft Verbindungen für 3min gesammelt platziert. Die Hauptkomponenten des Systems sowie die Einrichtung sind in Abbildung 1 dargestellt. Nach dieser letzten Dampfphase Extraktionsschritt die Fläschchen mit den Filtern noch angebracht sind auf einem Gestell angebracht und abkühlen.
15. Wenn der Filter Raumtemperatur wieder erreicht sie mit 150 ml Dichlormethan in ein 1,5 ml GC-Fläschchen mit einer Einlage versehen eluiert. Alter Ausblasen der restliche Lösungsmittel aus dem Filter die Vials verschlossen und analysiert mittels GC / MS.

Ein Gaschromatograph mit Split / Splitlos-Injektor (Splitless-Modus 250 ° C, Injektionsvolumen 1μ) Schnittstelle mit einem Massenspektrometer in chemische Ionisation-Modus (CI) betrieben für die Analyse verwendet werden) ausgestattet. Compounds basieren auf HP-1MS Säule (30m x 0,25 mm x 025μm) statt bei 40 ° C für 1 min nach der Injektion und dann bei 15 ° C programmiert / min auf 250 ° C (10 min), mit Helium als Trägergas Gas (constant flow 0.7ml/min). Für die MS-Analyse sowohl ein Quadrupol (zB Agilent HP5973) und einer Ionenfalle basiert (zB Varian Saturn 2200) Massenspektrometer verwendet werden kann. Als CI Gas entweder Isobutan (kommt in der Gas-Tanks) oder Methanol (Dämpfe aus einem Flüssigkeitsbehälter verwendet werden) verwenden können, aber in jedem Fall die Fragmente der Ionisierungsreaktion sollten vor dem ausgewählten Ionen-count (SIC) Programme überprüft werden geschaffen werden. Wir haben folgendes Programm für eine Varian GC 3900/Saturn MS 2200 System und Methanol als CI-Reagenz eingesetzt: 5.00-11.30min Ionen (M +1) ⁺ 153-158 (Methylsalicylat 153, ^Methyl-2 H _{5-Salicylat);} 11.30-13.30min Ionen (M +1) ⁺ 207-228 (Methyljasmonat 207 und 225, Methyldihydrojasmonat 209 und 227); 13.30-16.30min Ionen (M +1) ⁺ 237-300 (methyl Abscisinsäure 261, ^Methyl-2 H _{6-Abscisinsäure} 267 (Abscisinsäure produziert überwiegend [MH ₂ O +1] ^+-Ionen). Alle Verbindungen sollten durch Vergleich mit authentischen kommerziell erhältlichen Standards identifiziert werden. Quantifizierung von JA, SA, und ABA durch Korrelation der Peakfläche erfolgt (extrahierten Ionen) mit dem Peak-Fläche (extrahierten Ionen) der jeweiligen internen Standards und ist auch auf das Frischgewicht des Pflanzenmaterials verwendet wird.

Discussion

Die hier vorgestellte Methode hat sich bewährt, um zuverlässig arbeiten für eine breite Palette von pflanzlichen Signalstoffe, sofern die Größe und die chemische Natur der Verbindung nicht verhindern, dass es extrahiert, methyliert, und verdampft. Auch die Methylierung Verfahren, da es hier beschrieben ist nicht die einzige Möglichkeit der Derivatisierung. Silyllation und Acetylierung sind alternative Methoden und Protokolle können leicht gefunden werden online.

Wenn das Massenspektrometer nicht in der Lage Single Ion Monitoring Massenbereich, dass während eines Laufs aufgenommen wird, sollte begrenzt werden, um zu viele unerwünschte Ionen aus dem Prozess auszuschließen. Zum Beispiel produzieren Jasmonsäure (JA) und ihre internen Standard dihydro Jasmonsäure (dhJA) zwei große (M +1) ^+-Ionen, 207 und 225 für JA und 209 und 227 für dhJA während chemische Ionisation mit Methanol. Da diese beiden großen (M +1) ⁺ Massen (207 und 225 für JA; 209 und 227 für dhJA) nicht über die gleiche Fülle rationfor JA und dhJA, sollten beide extrahiert und verwendet werden für die Quantifizierung. Daher sollte ein Massenbereich von 207 bis 228 erfasst werden und die bestimmte Ionen sollte später extrahiert werden.