Monitoramento hormônios vegetais Durante Respostas ao Estresse

Summary

Um método simples é fornecida que permite a extração rápida e análise de hormônios vegetais múltiplos a partir de pequenas amostras de tecido. O procedimento utiliza extração em fase vapor como a etapa de purificação solene. As amostras são analisadas por íons GC / MS com ionização química que produz principalmente (M +1) +.

Abstract

Hormônios vegetais e compostos relacionados sinalização desempenhar um papel importante na regulação da resposta das plantas a diversos estímulos ambientais e tensões. Entre as tensões mais graves são herbivoria de insetos, infecção do patógeno e estresse hídrico. Para cada um destes sublinha um conjunto específico de hormônios e / ou suas combinações, são conhecidos por fazer um ajuste fino das respostas, garantindo assim a sobrevivência da planta. Os principais hormônios envolvidos na regulação dessas respostas são o ácido jasmônico (JA), ácido salicílico (SA), e ácido abscísico (ABA). Para entender melhor o papel dos hormônios individuais, bem como sua interação em potencial durante essas respostas é necessário para monitorar as mudanças em sua abundância em um temporal, assim como de uma forma espacial. Para a quantificação fácil, sensível e reprodutível destes e de outros compostos de sinalização foi desenvolvido um método baseado na extração em fase vapor e cromatografia / espectrometria de massa de gás análise (GC / MS) (1, 2, 3, 4). Depois de extrair estes compostos a partir do tecido vegetal por aquosa ácida 1-propanol misturado com diclorometano contendo o ácido carboxílico compostos são metilados, volatilizado sob o calor, e recolhidos em um absorvente polimérico. Após eluição em um frasco de amostra dos analitos são separados por cromatografia gasosa e detectada por espectrometria de massa de ionização química. O uso de normas internas apropriadas, em seguida, permite a quantificação simples, relacionando as áreas dos picos de analito e padrão interno.

Protocol

1. Primeiro, precisamos preparar o 2ml tampa de rosca frascos para extração: tampão de extração Adicionar 400ul (1-propanol: H2O: HCl concentrado 2:1:0.002 vol / vol / vol) e 10 ml do respectivo padrão interno (10ng/μl ) para um frasco. Congelamento em nitrogênio líquido e em seguida, adicione as contas de cerâmica.
2. Adicione o material vegetal (entre 50 e 200mg), enquanto os frascos ainda estão posicionados no nitrogênio líquido. Note que o peso do material vegetal adicionado deve ser estimado antes do processamento, que permitisse mais tarde para a quantificação exata, que é com base no peso fresco.
3. Certifique-se que todo o nitrogênio líquido é evaporado antes de fechar hermeticamente o frasco com uma tampa. Note que a tampa deve ter um selo de borracha para evitar derramamentos de solventes e, portanto, compostos extraídos durante a homogeneização.
4. Homogeneizar o tecido em um moedor FastPrep ou homogeneizador bead Precellys a uma velocidade de 6000 (para Precellys) por 30 seg.
5. Remova frascos de homogeneizador individualmente, abra cuidadosamente a tampa e adicione 1 ml de diclorometano a cada amostra. Frascos de fechar novamente com força e homogeneizar novamente por 10-15s em 6000 (Precellys).
6. Transferência de frascos para uma centrífuga de mesa e separar a fase orgânica da fase aquosa, a 10.000xg para 60seg.
7. Depois da separação de fase de transferência da camada inferior verde (fase orgânica, contém os hormônios e as normas internas) de frascos individuais a um frasco de vidro limpo 4ml. Evitar a transferência de água (fase superior). Alternativamente, acetato de etila pode ser usado ao invés de diclorometano. Nesse caso, a fase ethyacetate será a camada superior (verde) e é agora mais fácil de remover e transferido para um frasco de vidro fresco 4ml. Como antes, evitar a transferência de água.
8. Sopre o solvente com ar através de uma variedade de cerca de 10-25 min (depende da amostra); verificar com uma ponta de fluxo de ar único se as amostras são secas (cuidadosamente). Não amostras overdry, pois isso pode causar perdas de compostos.
9. Depois que as amostras são secas, podemos começar a metilação do ácido carboxílico contendo compostos nas amostras. Primeiro, 100 ul de uma mistura diethyether / metanol (9:1 vol / vol) são adicionados a cada frasco seguido por 4μl de uma solução trimethylsilyldiazomethane 2M (em hexano, Sigma Aldrich). Frascos são imediatamente fechadas com uma tampa de rosca open-top equipado com um septo de silicone recoberta com teflon. Agitar suavemente e incubar em temperatura ambiente por 25 a 30min.
10. Depois de terminar a etapa 9, por sua vez em um bloco de aquecimento e ajuste na temperatura desejada coleção. A volatilidade dos compostos metilados depende de seu tamanho, mas também em outros grupos mais polares, como = O,-OH e-NH. Para o ácido jasmônico e ésteres de ácido salicílico metil uma coleção de temperaturas em torno de 80 ° C são suficientes, enquanto que, por exemplo, outros compostos como ácidos graxos C18, conjugados do ácido jasmônico-amino ácido, coronatina, e éster metílico de 12-oxo-ácido phytodienoic requerem temperatura entre 180-200 ° C para efetivamente volatilizam.
11. Após incubação de 30 minutos a reação de metilação precisa ser interrompido para evitar a reação secundária indesejados. Isto é feito pela adição de 4 mL de uma solução 2M de ácido acético (em hexano) para cada frasco. Depois de fechar os frascos com tampa e um vórtice curto, as amostras estão autorizados a incubar por mais 30min.
12. Os filtros usados ​​para essa extração em fase vapor são feitas à mão e na forma apresentada, não disponível comercialmente. Eles consistem em um tubo de Teflon exterior (cerca de 7-8cm de comprimento), em que de um lado um tubo de vidro bem-encaixe de cerca de 4 centímetros de comprimento é inserido. Do outro lado do tubo de Teflon um disco de malha de aço inoxidável é empurrado para dentro do tubo até chegar ao tubo de vidro interior e em que cerca de 20-30mg de adsorvente (ou SuperQ 80/100 (descontinuado) ou HayeSep ® Q80/100) são adicionados. Outro disco malha de aço inoxidável é inserido e, finalmente, uma dica de vidro é empurra para dentro do tubo de teflon, assim, cuidadosamente pressionando o disco de malha de aço inoxidável sobre o absorvente. A imagem detalhada de um filtro é mostrado na figura 1.
    
    Figura 1.
13. Durante o tempo de incubação da etapa 11, os filtros para a coleta do metilado e, portanto, hormônios vegetais voláteis, devem ser lavados com 200ul primeiro de metanol, e depois duas lavagens com diclorometano 200ul cada. Solvente remanescente nos filtros é, então, arrancada por via aérea. Os filtros podem ser usados ​​para a captura de hormonas voláteis através de extração em fase vapor.
14. Após 30min de incubação dos septos de borracha do frasco de 4ml tampas são cortados com um bisturi. Para recolher os hormônios vegetais por extração em fase vapor os filtros limpos são conectados a linhas de vácuo individuais em um fluxo de cerca de 800ml/min. Os filtros são então inseridas no frasco através dos septos de corte. A ponta da pipeta pequenas também é inserido para atuar como uma entrada de ar. Durante esta parte inicial do procedimento os frascos com os filtros têm inserido a ser realizadaem posição vertical para evitar qualquer do líquido dentro do frasco para entrar em contato com a ponta de filtro, que contaminaria o filtro e, posteriormente, também o GC / MS. Os frascos são então detidas pela mão até todo o líquido é evaporado através do filtro. Em seguida, os frascos com os filtros ligados são colocados no bloco de aquecimento e calor evaporou compostos coletados para 3min. Os componentes principais do sistema, bem como a configuração são descritas na figura 1. Após esta última etapa de extração de fase vapor os frascos com os filtros ainda ligado são colocados em um rack e deixar arrefecer.
15. Quando os filtros de ter atingido a temperatura ambiente novamente, eles são eluídos com 150ml de diclorometano em um frasco de 1,5 ml GC-equipado com um insert. Alter soprar o solvente restante do filtro os frascos são limitadas e analisadas por GC / MS.

Um cromatógrafo a gás equipado com um injetor split / splitless (modo splitless 250 ° C, volume de injeção 1μ) interfaceado a um espectrômetro de massa operado em modo de ionização química (CI) devem ser utilizados para a análise). Compostos são separados em HP-1MS coluna (30m x 0,25 milímetros x 025μm), realizada a 40 ° C por 1min após a injeção, e depois a temperatura programada a 15 ° C / min a 250 ° C (por 10min), com hélio como o portador gás (0.7ml/min fluxo constante). Para a análise baseada em MS ambos, uma quadropole (por exemplo, Agilent HP5973) e um ion trap baseada em espectrômetro de massa (por exemplo, Varian Saturn 2200) pode ser usado. Como um gás CI ou isobutano (vem em tanques de gás) ou metanol (vapores de um reservatório de líquido são usados) pode ser usado, no entanto, em cada caso, os fragmentos da reação de ionização deve ser verificado antes da iões seleccionados count (SIC) programas são criados. Temos utilizado o seguinte programa para um 3900/Saturn GC Varian MS sistema de 2200 e metanol como reagente CI: 5.00-11.30min íons (M +1) ⁺ 153-158 (metil salicilato 153, metil salicilato ² H _5); 11,30-13.30min íons (M +1) ⁺ 207-228 (metil jasmonato 207 e 225, metil-diidrosjaminato 209 e 227); 13,30 16.30min-íons (M +1) ⁺ 237-300 (metil ácido abscísico 261, metil ² H do ácido abscísico _6-267 (ácido abscísico produz predominantemente [MH ₂ O +1] ⁺ íons). Todos os compostos devem ser identificados por comparação com padrões autênticos disponíveis comercialmente. Quantificação do JA, SA, e ABA é feito correlacionando a área do pico (extraído íons) com a área de pico (íons extraídos) do respectivo padrão interno e também com base no peso fresco do material vegetal usado.

Discussion

O método apresentado aqui tem sido comprovada para o trabalho de forma confiável para uma grande variedade de compostos de plantas de sinalização desde que o tamanho ea natureza química do composto não impedir que ele seja extraído, desnaturado, e vaporizado. Além disso, o processo de metilação como é descrito aqui não é a única maneira de derivatização. Silyllation e acetilação são métodos alternativos e protocolos pode ser facilmente encontrado on-line.

Se o espectrômetro de massa não é capaz de iões simples monitoramento da faixa de massa, que é gravado durante uma corrida deve ser limitado a excluir muitos íons indesejáveis ​​do processo. Por exemplo, o ácido jasmônico (JA) e seu padrão interno de ácido jasmônico dihidro (dhJA) produzem dois importantes (M +1) ⁺ íons, 207 e 225 para o JA, e 209 e 227 para dhJA durante químicas de ionização com metanol. Porque estes dois grandes (M +1) ⁺ massas (207 e 225 para o JA; 209 e 227 para dhJA) não têm a mesma abundância rationfor JA e dhJA, ambos devem ser extraído e utilizado para a quantificação. Portanto, uma faixa de massa 207-228 devem ser registrados e os íons específicos devem ser extraídos mais tarde.