Мониторинг завод гормонов во время реакции на стресс

Summary

Простой метод при условии, что дает возможность быстрого извлечения и анализа нескольких гормонов растений из небольшого образца ткани. Процедура использует пар экстракции как торжественные стадии очистки. Все результаты измеряются с помощью ГХ / МС с химической ионизации, которая производит в основном (M +1) + ионов.

Abstract

Завод гормонов и связанных с ним сигнализации соединения играют важную роль в регуляции завод реакции на различные стимулы окружающей среды и стрессов. Среди наиболее серьезных напряжений насекомых herbivory, возбудитель инфекции, и засухи. Для каждого из этих напряжений определенный набор гормонов и / или их комбинации, как известно, тонкая настройка ответов, тем самым обеспечивая выживание растений. Основных гормонов, участвующих в регулировании этих ответов жасмоновой кислота (JA), салициловая кислота (SA), и абсцизовой кислоты (АБК). Чтобы лучше понять роль отдельных гормонов, а также их потенциал взаимодействия в ходе этих реакций необходимо следить за изменениями в их обилие в временных, так и в пространственной форме. Для простой, чувствительный, и воспроизводимых количественных эти и другие сигнальные соединения мы разработали метод, основанный на паром экстракции и газовой хроматографии / масс-спектрометрии (GC / MS) анализ (1, 2, 3, 4). После извлечения этих соединений из растительной ткани при кислой водной 1-пропанол смешиваются с дихлорметана карбоновой кислоты содержащих соединения метилированной, испаряется под воздействием высокой температуры, и собираются на полимерные абсорбента. После элюирования в пузырек аналитов разделены с помощью газовой хроматографии и обнаружены химические масс-спектрометрии с ионизацией. Использование соответствующих внутренних стандартов затем позволяет по той простой количественный, связывая площадей пиков анализируемого и внутреннего стандарта.

Protocol

1. Для начала нам необходимо подготовить 2 мл завинчивающейся крышкой флакона для добычи: Добавить 400ul буфера добыча (1-пропанол: H2O: концентрированной соляной кислоты 2:1:0.002 об / об / об) и 10 мкл соответствующего внутреннего стандарта (10ng/μl ) на флаконе. Замораживание в жидком азоте, а затем добавить керамические бусины.
2. Добавить растительного материала (от 50 до 200 мг), а флаконах по-прежнему расположены в жидком азоте. Обратите внимание, что вес добавил растительный материал должен быть оценен перед дальнейшей обработкой, чтобы позже для точного количественного определения, которое основано на сырой вес.
3. Убедитесь, что все жидкий азот испаряется до плотно закрыть флакон с крышкой. Обратите внимание, что крышка должна иметь резиновое уплотнение для предотвращения разлива растворителей и, таким образом, извлеченный соединений во время гомогенизации.
4. Однородный ткани в FastPrep или Precellys бусинка мясорубку гомогенизатор на скорости 6000 (для Precellys) в течение 30 сек.
5. Удалить флаконы из гомогенизатора индивидуально, осторожно откройте крышку и добавить 1 мл дихлорметана к каждому образцу. Закрыть флаконах снова плотно и гомогенизации в течение 10-15сек на 6000 (Precellys).
6. Передача флаконах по настольной центрифуге и отдельных органической фазы от водной фазы при 10.000xg за 60 сек.
7. После разделения фаз передачи нижней зеленый слой (органической фазы, содержит гормоны и внутренние стандарты) от отдельных флаконах по 4 мл флакон чистым стеклом. Избегайте передачи воды (верхняя фаза). Кроме того, этилацетата может быть использован вместо дихлорметана. В этом случае ethyacetate этапе будет верхний слой (зеленый) и теперь легче удалить, и переданы в свежем 4 мл флакон стекло. Как и прежде, во избежание передачи воды.
8. Удар от растворителя с воздухом через коллектор в течение приблизительно 10-25 минут (зависит от выборки); проверить с одним наконечником воздуха, если образцы сухих (осторожно). Не пересушивать образцов, для этого может стать причиной потери соединения.
9. Как только образцы сушат мы можем начать метилирования карбоновой кислоты-содержащих соединений в наших образцах. Во-первых, 100 мкл diethyether / метанол (9:1 об / об) будут добавлены в каждом флаконе следует 4μl из 2 М раствора trimethylsilyldiazomethane (в гексане, Sigma Aldrich). Флаконы, немедленно закрыты с открытым верхом, винтовая крышка оснащена тефлоновым покрытием силиконовой перегородкой. Встряска мягко и инкубировать при комнатной температуре от 25 до 30 минут.
10. После окончания шаг 9, включите блок отопления и установлен на требуемый набор температуры. Волатильности метилированных соединений зависит от их размера, но и на другие, более полярные группы, такие как = O,-OH и-NH. Для жасмоновой кислоты и салициловой кислот метиловые эфиры коллекции температуре около 80 ° C достаточно, тогда как для других соединений, например, как C18 жирные кислоты, жасмоновой кислоты-амино конъюгатов кислоты, coronatine, и 12-оксо-phytodienoic эфир кислоты метил требуют температур между 180-200 ° C эффективно испаряться.
11. После 30 мин инкубации реакцию метилирования должна быть остановлена, чтобы избежать нежелательных вторичных реакции. Это делается путем добавления 4 мкл 2М ​​уксусной кислоты-решение (в гексане) для каждого флакона. После закрытия флаконы с крышками и короткие вортексе, образцы инкубировали в течение еще 30 минут.
12. Фильтры, используемые для этой добычи паровой фазы изготавливаются вручную и в представленном виде не на коммерческой основе. Они состоят из внешней трубе тефлон (около 7-8см в длину), в которую с одной стороны, хорошо сидящий стеклянной трубке около 4 см длиной вставлена. С другой стороны трубки Тефлоновые диск из нержавеющей стальной сеткой помещается внутри трубки, пока не достигнет внутренней стеклянной трубки и на том, что около 20-30мг адсорбента (либо SuperQ 80/100 (выпуск прекращен) или HayeSep ® Q80/100) добавлены. Другая сетка из нержавеющей стали вставлен диск и, наконец, стекло наконечник толкает в тефлоновой трубки, таким образом, тщательно нажатием диск из нержавеющей стальной сеткой на абсорбента. Детальную картину фильтра показана на рисунке 1.
    
    Рисунок 1.
13. Во время инкубации с шагом 11, фильтры для сбора метилированных и, таким образом, летучие растительные гормоны, должны быть вымыты с использованием первого 200ul метанола, а затем 2 промывок 200ul дихлорметана каждый. Растворителей, оставшихся в фильтрах то сдувается воздухом. Фильтры теперь можно использовать для захвата летучие гормоны через добычи паровой фазы.
14. После 30 мин инкубации резиновой перегородки 4 мл флакон шапки вырезаются с помощью скальпеля. Для сбора растительных гормонов на паровой фазе добычи очищать фильтры подключены к отдельным линиям вакууме при скорости потока около 800ml/min. Фильтры затем вставляется в пузырек через разрез перегородками. Небольшая заметка пипетки также вставляется в качестве воздуха на входе. За это начальная часть процедуры флаконах с вставлены фильтры должны быть проведеныв вертикальном положении, чтобы избежать любых жидкости внутри флакона, чтобы войти в контакт с фильтром наконечника, который будет загрязнять фильтр, а затем и GC / MS. Флаконы затем провел рукой, пока вся жидкость испаряется через фильтр. Затем флаконах с прилагаемой фильтры размещены на блоке отопления и теплового испарения соединений, собранных для 3мин. Основные компоненты системы, а также установки изображены на рисунке 1. После этого последний шаг экстракции пара флаконов с фильтрами еще привязаны расположены на стойке и дать ему остыть.
15. Когда фильтры достигли комнатной температуры они элюировали 150 мл дихлорметана в 1,5 мл GC-флакон снабжен вставкой. Alter выдува оставшегося растворителя из фильтра флаконов ограничено и проанализированы с помощью ГХ / МС.

Газовый хроматограф оснащен разделить / без деления потока инжектора (без деления потока режиме 250 ° С, объемом впрыска 1μ) сопряжено с масс-спектрометр работает в режиме химической ионизации (CI) должны быть использованы для анализа). Соединения разделяются на HP-1 мс колонке (30 м х 0,25 мм х 025μm), которая состоялась при температуре 40 ° С в течение 1 мин после инъекции, а затем температуру запрограммированной при 15 ° С / мин до 250 ° C (в течение 10 минут), с гелием в качестве перевозчика газа (постоянная 0.7ml/min потока). Для MS-анализа на основе обоих, quadropole (например, Agilent HP5973) и ионной ловушки основе (например, Сатурн Varian 2200) Масс-спектрометр может быть использован. Как газа CI либо изобутан (поставляется в газовых баллонов) или метанола (паров жидкости резервуара используется) можно использовать, однако, в каждом случае фрагменты ионизации реакция должна быть проверена перед выбранным ионом счетчик (SIC) программ создаются. Мы использовали следующую программу Varian GC 3900/Saturn MS 2200 системы и метанола в качестве реагента ДИ: 5.00-11.30min ионов (М + 1) ⁺ 153-158 (метиловый салицилат 153, ^метил-2 H _{5-салицилат);} 11.30-13.30min ионов (М + 1) ⁺ 207-228 (метил jasmonate 207 и 225, метил dihydrojasmonate 209 и 227), 13.30-16.30min ионов (М + 1) ⁺ 237-300 (метил абсцизовой кислоты 261, ^метил-2 Н _{6-абсцизовой} кислоты 267 (абсцизовой кислоты производит преимущественно [MH ₂ O +1] ⁺ ионов). Все соединения должны быть идентифицированы путем сравнения с подлинными коммерчески доступных стандартов. Количественная оценка JA, SA, и АБК осуществляется путем сопоставления площади пика (извлечения ионов) с площади пика (извлеченные ионы) соответствующего внутреннего стандарта, а также на основе сырого веса растительного материала используются.

Discussion

Метод, представленный здесь, как доказывали, надежно работать для широкого спектра растений сигнализации соединений при условии, что размер и химической природе соединение не мешает ему быть извлечены, метилированный, и испаряется. Кроме того, метилирование процедуру, как это описано в настоящем документе, не единственный способ дериватизации. Silyllation и ацетилирования и альтернативные методы и протоколы можно легко найти в Интернете.

Если масс-спектрометр не может быть предметом отдельного иона мониторинга диапазоне масс, записанные во время запуска должно быть ограничено, чтобы исключить слишком много нежелательных ионов из процесса. Например, жасмоновой кислота (JA) и его внутренний стандарт дигидро жасмоновой кислоты (dhJA) производят два основных (M +1) ⁺ ионов, 207 и 225 для JA, и 209 и 227 для dhJA при химической ионизации с метанолом. Потому что эти два крупных (М +1) ⁺ массы (207 и 225 для JA; 209 и 227 для dhJA) не имеют той же обилие rationfor JA и dhJA, они должны оба быть извлечены и использованы для количественной оценки. Таким образом, масса варьируется от 207 до 228 должны быть зарегистрированы и конкретных ионов должны быть извлечены позже.