Surveillance des hormones végétales Durant les réponses au stress

Summary

Une méthode simple est fourni qui permet l'extraction rapide et l'analyse des hormones végétales multiples à partir de petits échantillons de tissu. La procédure utilise l'extraction en phase vapeur comme l'étape de purification solennelle. Les échantillons sont analysés par des ions + GC / MS avec ionisation chimique qui produit principalement des (M +1).

Abstract

Les hormones végétales et des composés apparentés de signalisation jouent un rôle important dans la régulation des réponses des plantes à divers stimuli environnementaux et les contraintes. Parmi les contraintes les plus sévères sont insectes herbivores, une infection pathogène, et la sécheresse. Pour chacune de ces contraintes un ensemble spécifique d'hormones et / ou de leurs combinaisons sont connues pour affiner les réponses, assurant ainsi la survie de la plante. Les principales hormones impliquées dans la régulation de ces réponses sont l'acide jasmonique (JA), l'acide salicylique (SA), et l'acide abscissique (ABA). Pour mieux comprendre le rôle des hormones individuelles ainsi que leur interaction potentielle lors de ces réponses, il est nécessaire de surveiller les changements dans leur abondance dans un temporel aussi bien que de façon spatiale. Pour la quantification facile, sensible et reproductible de ces signaux et d'autres composés que nous avons développé une méthode basée sur l'extraction en phase vapeur et la chromatographie gazeuse / spectrométrie de masse (GC / MS) (1, 2, 3, 4). Après l'extraction de ces composés à partir des tissus végétaux par aqueuse acide 1-propanol mélangé avec de l'acide dichlorométhane contenant des composés carboxyliques sont méthylés, volatilisés par la chaleur, et recueilli sur un absorbant polymères. Après élution dans un flacon d'échantillon des analytes sont séparés par chromatographie gazeuse et détectés par spectrométrie de masse à ionisation chimique. L'utilisation de normes internes appropriées permet alors de la simple quantification en reliant les zones pic de l'étalon analyte et internes.

Protocol

1. Nous devons d'abord préparer le bouchon à vis 2ml flacons pour l'extraction: Ajouter un tampon d'extraction 400ul (1-propanol: H2O: HCl concentré 2:1:0.002 vol / vol / vol) et 10 pi de la norme interne respective (10ng/μl ) dans un flacon. Gel dans l'azote liquide, puis ajouter les perles en céramique.
2. Ajouter de la matière végétale (entre 50 et 200mg) alors les flacons sont toujours positionnés dans l'azote liquide. Notons que le poids de la matière végétale ajoutée doit être estimé avant tout autre traitement pour permettre à plus tard pour la quantification exacte, qui est basé sur le poids frais.
3. Assurez-vous que tout l'azote liquide est évaporé avant à fermeture hermétique du flacon avec un bouchon. Notez que la PAC doit avoir un joint en caoutchouc pour empêcher les déversements de solvants et donc, composés extraits lors de l'homogénéisation.
4. Homogénéiser le tissu dans un homogénéisateur Precellys FastPrep ou meuleuse billes à une vitesse de 6000 (pour les Precellys) pendant 30 sec.
5. Retirez les flacons d'homogénéisateur individuellement, ouvrir avec précaution le bouchon et ajoutez 1 ml de dichlorométhane à chaque échantillon. Fermer hermétiquement les flacons à nouveau et homogénéiser à nouveau 10-15sec à 6000 (Precellys).
6. Transfert des flacons d'une centrifugeuse de table et de séparer la phase organique de la phase aqueuse à 10.000xg pour 60sec.
7. Après séparation des phases de transfert de la couche inférieure verte (phase organique, contient les hormones et les normes internes) de flacons individuels dans un flacon en verre 4ml propre. Eviter le transfert d'eau (phase supérieure). Alternativement, l'acétate d'éthyle peut être utilisé au lieu du dichlorométhane. Dans ce cas, la phase ethyacetate sera la couche supérieure (vert) et il est maintenant plus facile à enlever et transféré dans un flacon en verre 4ml frais. Comme avant, éviter le transfert de l'eau.
8. Soufflez le solvant avec de l'air grâce à un collecteur d'environ 10-25 min (dépend de l'échantillon); vérifiez avec une pointe d'air unique si les échantillons sont secs (avec soin). Ne pas trop sécher les échantillons, cela pourrait causer des pertes de composés.
9. Une fois les échantillons sont séchés, nous pouvons commencer la méthylation de l'acide carboxylique contenant des composés dans nos échantillons. Tout d'abord, 100 ul d'un mélange diethyether / méthanol (9:1 vol / vol) sont ajoutés à chaque flacon suivie par 4μl d'une solution 2M triméthylsilyldiazométhane (dans l'hexane, Sigma Aldrich). Les flacons sont immédiatement fermé avec un bouchon à vis open-top équipé d'un septum en silicone de téflon. Agiter doucement et incuber à température ambiante pendant 25 à 30min.
10. Après avoir terminé l'étape 9, tourner sur un bloc de chauffage et de mettre à la température désirée de collecte. La volatilité des composés méthylés dépend de leur taille, mais aussi sur les autres groupes, plus polaires tels que = O,-OH, et-NH. Pour l'acide jasmonique et esters méthyliques d'acide salicylique, une collection de températures autour de 80 ° C sont suffisantes, alors que, par exemple d'autres composés comme les acides gras C18, jasmonique conjugués d'acide acide aminé, coronatine, et 12-oxo-phytodienoic ester méthylique d'acide nécessitent de température entre 180-200 ° C efficacement volatiliser.
11. Après une incubation de 30min de la réaction de méthylation doit être arrêté afin d'éviter indésirables réaction secondaire. Cela se fait par addition de 4 pi d'un mélange acide acétique-2M solution (dans l'hexane) pour chaque flacon. Après la fermeture des flacons avec des bouchons et un vortex bref, les échantillons sont laissés à incuber pendant encore 30 min.
12. Les filtres utilisés pour cette extraction en phase vapeur sont faites à la main et dans la forme présentée n'est pas disponible commercialement. Ils sont constitués d'un tube extérieur en Téflon (environ 7-8cm de long), dans laquelle d'un côté un tube de verre bien ajusté d'environ 4cm de longueur est inséré. De l'autre côté du tube de téflon d'un disque en acier inoxydable maille est poussé dans le tube jusqu'à ce qu'il atteigne le tube de verre intérieure et sur qu'environ 20 à 30 mg d'adsorbant (soit SuperQ 80/100 (interrompu) ou HayeSep ® Q80/100) sont ajoutés. Un autre disque inox maille d'acier est insérée et, enfin, un bout de verre est poussé dans le tube en Téflon, ce soin en appuyant sur le disque en acier inoxydable maille sur l'absorbant. Un portrait détaillé d'un filtre est montré dans la figure 1.
    
    Figure 1.
13. Pendant le temps d'incubation de l'étape 11, les filtres pour la collecte de l'méthylé et donc, les hormones végétales volatiles, doivent être lavés à l'aide 200ul d'abord le méthanol, puis 2 lavages avec du dichlorométhane 200ul chacun. Solvant restant dans les filtres est alors emportée par l'air. Les filtres peuvent maintenant être utilisés pour le piégeage des hormones volatiles par extraction en phase vapeur.
14. Après 30min d'incubation, les cloisons en caoutchouc du flacon 4ml bouchons sont coupées avec un scalpel. Pour recueillir les hormones végétales par extraction en phase vapeur des filtres nettoyés sont connectés à des lignes vide individuelles à un débit d'environ 800ml/min. Les filtres sont ensuite insérées dans le flacon à travers le septum coupé. Une petite pointe de pipette est également inséré pour agir comme une entrée d'air. Durant cette partie initiale de la procédure des flacons avec les filtres insérés doivent être tenusdans une position verticale pour éviter tout du liquide à l'intérieur du flacon pour entrer en contact avec l'extrémité du filtre, ce qui pourrait contaminer le filtre et ensuite aussi la GC / MS. Les flacons sont ensuite tenu la main jusqu'à ce que tout le liquide soit évaporé à travers le filtre. Puis les flacons avec les filtres ci-joints sont placés sur le bloc de chauffage et de la chaleur évaporée composés recueillis pour 3min. Les principaux composants du système ainsi que la configuration sont représentés dans la figure 1. Après cette dernière étape d'extraction en phase vapeur des flacons avec les filtres encore attaché sont placés sur une grille et laisser refroidir.
15. Quand les filtres ont atteint la température ambiante de plus, ils sont élues avec 150 ml de dichlorométhane dans un 1,5 ml GC-flacon équipé d'un insert. Alter souffler le solvant restant dans le filtre les flacons sont bouchés et analysé par GC / MS.

Un chromatographe en phase gazeuse équipé d'un injecteur split / splitless (mode splitless à 250 ° C, le volume d'injection 1μ) interfacé à un spectromètre de masse fonctionnant en mode d'ionisation chimique (CI) doit être utilisé pour l'analyse). Les composés sont séparés sur HP-1MS colonne (30m x 0.25mm x 025μm) qui s'est tenue à 40 ° C pendant 1min après l'injection, puis la température programmée à 15 ° C / min à 250 ° C (pour 10min), avec l'hélium comme le transporteur gaz (0.7ml/min débit constant). Pour l'analyse MS-fondé à la fois, un quadropole (par exemple Agilent HP5973) et un piège à ions à base spectromètre de masse (par exemple Varian Saturn 2200) peuvent être utilisés. Comme un gaz CI soit l'isobutane (livré dans des réservoirs à gaz) ou le méthanol (vapeurs d'un réservoir de liquide sont utilisés) peut être utilisé, cependant, dans chaque cas, les fragments de la réaction d'ionisation doit être vérifié avant l'sélectionnée ions count (CTI) des programmes sont créés. Nous avons utilisé le programme suivant pour un Varian GC 3900/Saturn système MS 2200 et le méthanol comme réactif IC: 5.00-11.30min ions (M +1) ⁺ 153 à 158 (salicylate de méthyle 153, le ^méthyl-2 H ₅ salicylate); 11.30-13.30min ions (M +1) ⁺ 207 à 228 (jasmonate de méthyle 207 et 225, 209 et méthyl dihydrojasmonate 227); 13,30 16.30min-ions (M +1) ⁺ 237 à 300 (méthyl acide abscissique 261, ^méthyl-2 H _6-acide abscissique 267 (acide abscissique produit principalement [MH ₂ O 1] ⁺ ions). Tous les composés doivent être identifiés par comparaison avec d'authentiques normes disponibles dans le commerce. Quantification des JA, SA, et ABA est fait en corrélant la surface du pic (extrait des ions) avec la surface du pic (ions extraits) de la norme internes respectives et est également basée sur le poids frais de la matière végétale utilisée.

Discussion

La méthode présentée ici a été prouvée à travailler de manière fiable pour un large éventail de composés végétaux de signalisation condition que la taille et la nature chimique du composé ne l'empêche pas d'être extraite, méthylé, et vaporisé. En outre, la procédure de méthylation comme il est décrit ici n'est pas le seul moyen de dérivation. Silyllation et l'acétylation des méthodes alternatives et des protocoles peuvent être facilement trouvés en ligne.

Si le spectromètre de masse n'est pas capable d'ion unique de surveillance de la gamme de masse qui est enregistrée pendant une course doit être limitée afin d'exclure un trop grand nombre d'ions indésirables de ce processus. Par exemple, l'acide jasmonique (JA) et son étalon interne d'acide dihydro jasmonique (dhJA) produisent deux grands (M +1) ⁺ ions, 207 et 225 pour le juge, et 209 et 227 pour les cours dhJA ionisation chimique avec du méthanol. Parce que ces deux grands (M +1) ⁺ masse (207 et 225 pour JA; 209 et 227 pour dhJA) n'ont pas les mêmes abondance rationfor JA et dhJA, ils devraient tous deux être extraits et utilisés pour la quantification. Par conséquent, une gamme de masse de 207 à 228 devraient être enregistrées et les ions spécifiques devraient être extraites plus tard.