Summary
Здесь мы демонстрируем, изготовление коллагена основе, тканевые конструкции содержащего скелетных миобластов. Эти 3-D инженерных конструкций может быть использован для замены или ремонта тканей
Abstract
Несмотря на то, что электронные кардиостимуляторы являются жизненно медицинских приборов, их долгосрочную работу в педиатрической практике может быть проблематичным из-за ограничений, налагаемых небольшой размер ребенка и их неизбежного роста. Следовательно, существует реальная потребность в инновационных терапий, разработанный специально для педиатрических пациентов с нарушения сердечного ритма. Мы полагаем, что проводящие биологические альтернативные, состоящий из коллагена основе матрицы, содержащей autologously клеток, полученных могли лучше адаптироваться к росту, снизить потребность в периодических операций, а также значительно улучшить качество жизни этих пациентов. В настоящем исследовании мы опишем процедуру включения первичных культурах клеток скелетных миобластов в гидрогель матрицы моде хирургически-имплантируемых тканей конструкция, которая будет служить связующим звеном между электрическими верхней и нижней палат сердце. В конечном счете, мы ожидаем, используя этот тип инженерии тканей для восстановления атриовентрикулярного электрической проводимости у детей с полной блокадой сердца. В связи с этим, мы выделяем миобластов из скелетных мышц у новорожденных крыс Льюиса и пластины их на ламинин покрытием культуре ткани блюда с использованием модифицированной версии установленными протоколами
Protocol
Часть 1: Соберите построить литейных форм
- Используйте лезвие сократить вдвое силиконовые трубки (VWR) и разрезать его на 3 см длиной штук.
- Место падения имплантата класса RTV силиконовый клей (Rhodia) на внутренней стороне каждого конца трубки.
- Быстро месте небольшой кусочек (1 см х 1 см) из полиэфирной сетки (McMaster-Карр) на падение силиконовый клей и согласовать ее с конца трубы. Это позволит слегка приподняты и плоскую поверхность для построить вложение. Повторите для другой стороны.
- Разрешить форму сушить при комнатной температуре в течение 3 дней. Это полезно сделать от 20 до 30 форм в то время, как эти по сути одноразовыми.
- Как только клей полностью высохнет, хранения этих форм в стакан заполнен на 70% этанола, пока они не нужны. Этот шаг поможет стерилизовать пресс-форм и готовой продукции показана на рисунке 1.
Часть 2: Подготовка к миобластов изолятор
- Развести 1 мг Ламинин (Sigma) в 250 мл 0,22 мкм фильтр-стерилизовать фосфатным буферным раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen) и 1% Fungizone (Invitrogen).
- Пальто 150 мм пластин культуре ткани (BD Falcon) с 4 мл разведенного раствора Ламинин с шагом 1,1 и инкубировать при температуре 37 ° С в течение по крайней мере за 4 часа до покрытия первичных скелетных миобластов.
- Сделать миобластов средой путем смешивания F-10 Хэма питательной смеси (Sigma) с 20% FBS (Атланта биологические препараты), 5 нг / л основной фактор роста фибробластов (Promega), 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen), и 1% Fungizone ( Invitrogen).
- Подготовка скелетных мышц решение пищеварения, растворяя 1 г ~ 295 ед / мг Коллагеназа 2 (Уортингтон) в 100 мл 2,4 Ед / мл Dispase-2 (Roche). Добавить 0,037 г CaCl 2 и хорошо перемешать. Фильтры стерилизовать пищеварения буфера, используя фильтр 0,2 мкм диск устанавливается на 10 мл шприц и хранить аликвоты при -20 ° C. Место суммы, необходимой для переваривания ткани при температуре 37 ° С, наряду с миобластов СМИ.
Часть 3: миобластов изоляции от скелетных мышц
- Использование щипцов и маленькие ножницы, удалите параспинальная мышц из мертвых новорожденных крыс Льюиса, нарезая на спине вдоль позвоночника, шелушение кожи спины и шеи слои, а затем иссечения мышц.
- В капотом культуры ткани, место вырезанной мышцы в 50 мл коническую трубку (BD Falcon) заполнены 40 мл 1X Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) (Invitrogen) на льду. Разрешить мышц полосок для оседают на дне пробирки и тщательно удалить большую часть жидкости и крови остатки от вакуумного отсоса с стерильные пипетки Пастера в культуре капот (Baker).
- Налейте собрано части мышц на 150 мм культуры блюдо и удалить как можно больше из оставшейся жидкости, насколько это возможно всасывание. Используя 2 однолезвийный лезвия фарш ткани густой пасты. Налейте подогретого раствора на пищеварение пасты и передачи смесь 50 мл свежего трубки с использованием 10 мл пипетки. Во время ферментативного пищеварения, ткани, иногда растирали в порошок (без восходящей) с 10 мл пипетки устанавливается на беспроводные Внесите-Aid (Drummond). Опять же, позволит урегулировать ткани и удалить лишнюю жидкость.
- Место трубки на качалке платформы и переварить при 37 ° С в течение примерно 30 мин.
- Как только мышцы сжиженный, проходят раствора через 70 мкм ячейки фильтра (BD Falcon) и центрифуги при комнатной температуре в течение 10 мин при 600 мкг (Beckman GP). С пипетки Пастера и всасывания, удалить как можно больше жидкости, как это возможно и ресуспендируют осадок с 10 мл теплой среде миобластов.
- Предварительно пластина ячеек на 150 мм без покрытия тканевой культуры пластине в течение 15 минут, чтобы помочь устранить фибробластов.
- Передача клетки, которые еще не прикреплен к ламинин покрытием cultureware и разбавленных так, что есть одна пластина для каждого от 1 до 2 крысят. Место пластины в увлажненной термостат при температуре 37 ° C с 5% CO 2.
Часть 4: Литье инженерных конструкций ткани (5 мл)
- После 1 до 2 дней, удалите 10 из 150 мм миобластов культуре ткани пластины из инкубатора, промойте их в два раза с 37 ° C 1X PBS, и добавить 4 мл теплого 0,05% трипсина-EDTA в каждую тарелку. Вернуться пластин инкубаторе в течение 5 мин.
- Harvest отдельностоящий миобластов из пластин в культуре капот и собрать жидкость в 50 мл трубки (BD Falcon). Используйте 10 мл миобластов среда для полоскания все тарелки и совместить это с клетками в центрифуге трубки. Гранул клетки при комнатной температуре в течение 10 мин при 600 мкг (Beckman GP) и удалить лишнюю жидкость, как описано в пункте 3.5.
- Ресуспендируют миобластов клеток в 1,6 мл среды миобластов и место на льду.
- Использование щипцов, тщательно удалить 4 строить формы, начиная с шага 1.5 и промойте их в два раза с 1X PBS. Вакуумные всасывания от всех следов PBS с пипетки Пастера до размещения каждой формы в 6-а у.е. тканиlture пластины (BD Falcon).
- Соберите другие реагенты, необходимые для подготовки построить (F10 10X Хэма, антибиотики, 1-го типа коллагена [3,9 мг / мл] [6] и Матригель ™) на льду и держать миобластов СМИ при 37 º C. Комбинат 500 мкл 10X Хэма F10, 100 мкл Пенициллин / стрептомицин, 100 мкл Fungizone, 1,6 мл коллагена, и 750 мкл ™ Матригель в 15 мл коническую трубку. Смешайте раствор на 10 сек использованием мини-Vortexer (VWR) установлен в 10 и место на льду.
- Затем добавьте 80 мкл NaHCO 3 и миобластов отстранение от шага 3,3 до смеси из шага 3.5. Vortex всю смесь в течение 10 сек и вернуть трубку ведерко со льдом в течение нескольких минут, чтобы очистить решение пузыри.
- Тщательно литой смеси в формы, прежде чем он начинает затвердевать использованием 10 мл пипетки. Каждая форма будет принадлежать примерно 1 мл вязкой жидкости. Старайтесь избегать введения пузырьков воздуха во время этой процедуры.
- Тщательно передачи пластины, содержащей литые конструкции для инкубатора. После ~ 30 мин, удалить затвердевших конструкций из инкубатора и осторожно добавить миобластов среду в каждую лунку, чтобы покрыть ткань конструкции. Вернуться пластину инкубаторе (рис. 2).
Часть 5: Представитель результаты
При этом протокол надлежащим образом оформленные, миобластов, содержащие ткани построить готов к имплантации в естественных условиях (например, когда вынимается из формы) или для дальнейшего анализа в пробирке через 2 дня.
Рисунок 1. Примеры выполненных построить формы (см. шаг 1.5).
Рисунок 2. Затвердевших миобластов содержащие ткани построить [1].
Рисунок 3. H & E окрашенных срезах миобластов содержащие ткани конструкции. "" Изображает продольный разрез и "B" показывает поперечное сечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Формы, в которых ткани строить будут брошены может быть сделано в любой форме и размеру, однако, там должно быть не менее двух точек крепления. В противном случае, матрицы и клетки образуют сферические структуры и клетки погибают. В настоящее время протокол, мы описываем использование полиэфирной сетки для этой цели, но мы также успешно используется сетка из нержавеющей стали. Очевидно, что большие формы потребуется больше клеток и больший объем других ингредиентов. При создании формы, важно, чтобы свести к минимуму количество силикона используемого клея и гарантировать, что он расположен в самом концах трубы. Это потому, что рядом миобластов клея как правило, не жизнеспособны, даже после нескольких дней лечения. Кроме того, целесообразно, чтобы пластины миобластов только день или два до подготовки ткани конструкций, как загрязнение фибробласты будут быстро размножаться и в конце концов подавить миогенной компонентов культуры. Кроме того, миобластов не должны быть покрыты плотной, поскольку клетки в контакте друг с другом начнут сливаться и дифференцироваться в myotubes. В связи с изготовлением ткани конструкций, Есть целый ряд коммерчески доступных источников коллагена типа 1, однако, каждый продемонстрировать различия в скорости затвердевания и консистенция готового продукта. Кроме того, важно, что коллаген Препарат не облучении УФ-светом, как этот процесс тормозит процесс гелеобразования. В наших руках, конструкции меняют цвет с темно-розового до светло-розового во время затвердевания. Наконец, наши коллагена препарата кислотно-solublized (не перевариваются пепсином), поэтому рН смеси в шаге 3,5 должна быть увеличена путем добавления NaHCO 3, прежде чем включать клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитетом на Детской больнице Бостона.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке грантов от Национального института здоровья (HL068915; HL088206), Новая премия исследователь из Фонда исследований Трэшер и вклад в сердечной фонд Проведение в Детской больнице Бостона.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
