Summary
Här visar vi tillverkning av kollagen-baserade konstruktioner vävnad innehåller skelett myoblasts. Dessa 3-D-tillverkade konstruktioner kan användas för att ersätta eller reparera vävnader
Abstract
Trots att elektroniska pacemaker är livräddande medicinsk utrustning, kan deras långsiktiga resultat hos barn vara problematisk på grund av de begränsningar som ett barns lilla storlek och deras oundvikliga tillväxt. Följaktligen finns det ett verkligt behov av innovativa terapier som utformats speciellt för barn med hjärtrytm störningar. Vi föreslår att en ledande biologiskt alternativ som består av en kollagenbaserade matris som innehåller autologously som härrör cellerna bättre kan anpassa sig till tillväxten, minska behovet av återkommande operationer, och avsevärt förbättra livskvaliteten för dessa patienter. I den aktuella studien beskriver vi en metod för att införliva primär skelett kulturer myoblast cell inom en hydrogel matris till mode ett kirurgiskt implanterbara vävnad konstruktion som kommer att fungera som en elektrisk ledning mellan övre och undre kammare i hjärtat. I slutändan räknar vi använda denna typ av vävnadstekniska att återställa atrioventrikulär elektrisk ledningsförmåga hos barn med komplett hjärtblock. Med tanke på att isolera vi myoblasts från skelettmuskulaturen av neonatal Lewis råttor och platta ut dem på laminin-belagd vävnadsodling rätter med hjälp av en modifierad version av fastställda protokoll
Protocol
Del 1: Montera bygga gjutformar
- Använd ett rakblad för att halvera silikonslang (VWR) och skär den i 3 cm långa bitar.
- Placera en droppe implantat-grade RTV silikon lim (Rhodia) på insidan av vardera änden av slangen.
- Snabbt placera en liten bit (1 cm x 1 cm) av polyester mesh (McMaster-Carr) på silikonytskikt sjunka och rikta in det mot slutet av slangen. Detta kommer att ge en något höjd och plan yta för att konstruera fäste. Upprepa för den andra änden.
- Låt formen torka i rumstemperatur i 3 dagar. Det är bra att göra 20 till 30 formar på en gång, eftersom dessa är i huvudsak engångsbruk.
- När limmet är helt torr, lagra dessa formar i en bägare fylld med 70% etanol tills de behövs. Detta steg kommer att hjälpa sterilisera formar och färdig produkt visas i figur 1.
Del 2: Förberedelse för myoblast cell isolering
- Späd 1 mg Laminin (Sigma) i 250 ml 0,22 ìm filter-steriliserade fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 1% Penicillin / streptomycin (Invitrogen) och 1% Fungizone (Invitrogen).
- Coat 150 mm vävnadsodling plattor (BD Falcon) med 4 ml av den utspädda Laminin lösningen från steg 1,1 och inkubera vid 37 ° C i minst 4 timmar innan bordläggning den primära skelettet myoblasts.
- Gör myoblast mediet genom att blanda Hams F-10 Nutrient Blandning (Sigma) med 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L grundläggande Fibroblast Growth Factor (Promega), 1% Penicillin / streptomycin (Invitrogen), och 1% Fungizone ( Invitrogen).
- Förbered skelett lösningen muskeln matsmältningen genom upplösning av 1 g ~ 295 U / mg kollagenas 2 (Worthington) i 100 ml 2,4 U / mL Dispase-2 (Roche). Tillsätt 0,037 g CaCl 2 och blanda väl. Filtrera sterilisera matsmältningen bufferten med hjälp av en 0,2 ìm filter skiva monterad på en 10 ml spruta och alikvoter förvara vid -20 ° C. Placera den mängd som behövs för vävnad rötning vid 37 ° C tillsammans med myoblast media.
Del 3: Myoblast isolering från skelettmuskulatur
- Använd pincett och en liten sax, ta bort paraspinal muskler från döda neonatala Lewis råttor genom skärning ner tillbaka längs ryggmärgen, peeling tillbaka huden och lager fascia och sedan excising musklerna.
- I en vävnadskultur huva, placera exciderad muskler i ett 50 ml koniskt rör (BD Falcon) fylld med 40 ml 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Invitrogen) på is. Låt muskeln band att bosätta sig på botten av röret och dra försiktigt bort det mesta av vätskan och blod rester med vakuum med en steril pasteurpipett i en kultur huva (Baker).
- Häll skördade muskeln bitarna på en 150 mm kultur skålen och ta bort så mycket av de återstående vätska som möjligt med sug. Använda 2 enkla kanter rakblad färs vävnaden till en tjock smet. Häll förvärmda matsmältningen lösningen på pasta och överför blandningen till ett nytt 50 ml rör med hjälp av en 10 ml pipett. Under enzymatisk spjälkning är vävnaden ibland grov-(utan bubblande) med en 10 ml pipett monterad på en sladdlös Pipettera-Aid (Drummond). Återigen gör vävnaden för att reglera och ta bort överflödig vätska.
- Placera röret på en gungande plattform och smälta vid 37 ° C i ca 30 min.
- När muskeln är flytande, låt lösningen rinna genom ett 70 ìm cell sil (BD Falcon) och centrifugera i rumstemperatur i 10 minuter vid 600 xg (Beckman GP). Med en Pasteur pipett och sug, ta bort så mycket av vätskan som möjligt och suspendera pelleten i 10 ml varmt myoblast medium.
- Pre-platta cellerna på ett obestruket 150 mm vävnadsodling plåt i 15 minuter för att ta bort fibroblaster.
- Överför de celler som ännu inte ansluten till laminin-belagda cultureware och späd så att det finns en skylt för varje 1 till 2 råttungar. Placera plattan i en fuktig kuvös inställd på 37 ° C med 5% CO 2.
Del 4: Gjutning vävnadstekniska konstruktioner (5 ml)
- Efter 1 till 2 dagar, ta bort 10 av de 150 vävnad mm myoblast odlingsplattor från inkubatorn, skölj två gånger med 37 ° C 1X PBS och tillsätt 4 ml varmt 0,05% Trypsin-EDTA för varje platta. Återgå plattorna till inkubatorn i 5 minuter.
- Skörda lossnat myoblasts från plattorna i kulturen huva och samla vätskan i en 50 ml rör (BD Falcon). Använd 10 ml myoblast medel att skölja alla tallrikar och kombinera detta med celler i centrifugrör. Pellets cellerna vid rumstemperatur i 10 minuter vid 600 xg (Beckman GP) och ta bort överflödig vätska som beskrivs i steg 3,5.
- Resuspendera myoblast cellerna i 1,6 ml myoblast medelstora och placera på is.
- Använd pincett, försiktigt bort 4 konstruera formar från steg 1,5 och skölj dem två gånger med 1X PBS. Vakuumsug bort alla spår av PBS med en pasteurpipett innan han släpper ut mögel i en 6-väl vävnad culture plattan (BD Falcon).
- Samla andra reagenser som behövs för bygga beredning (10X Hams F10, antibiotika, typ 1 kollagen [3,9 mg / ml] [6] och Matrigel ™) på is och hålla myoblast medier vid 37 º C. Kombinera 500 mikroliter 10X Hams F10, 100 mikroliter Penicillin / streptomycin, 100 mikroliter Fungizone, 1,6 ml kollagen, och 750 mikroliter Matrigel ™ i ett 15 ml koniskt rör. Blanda lösningen för 10 sek med hjälp av en Mini-Vortexer (VWR) satt till 10 och placera på is.
- Lägg sedan till 80 mikroliter av NaHCO 3 och myoblast avstängning från steg 3,3 till blandningen från steg 3,5. Vortex hela blandningen i 10 sekunder och återgå röret till ishink i några minuter för att rensa lösning av bubblor.
- Försiktigt kastade blandningen i formarna innan det börjar stelna med hjälp av en 10 ml pipett. Varje mögel kommer att inneha cirka 1 mL av trögflytande vätska. Försök att undvika att införa luftbubblor under denna procedur.
- Försiktigt överföra skylt som innehåller den gjutna konstruktioner till inkubatorn. Efter ~ 30 minuter, ta bort den stelnade konstruktioner från kuvösen och tillsätt försiktigt myoblast medellång till varje brunn för att täcka vävnaden konstruera. Återgå plattan i inkubatorn (figur 2).
Del 5: representativa resultat
När protokollet väl utförs, är myoblast-innehållande vävnad konstruera klar för in vivo-implantation (dvs när de tas bort ur formen) eller för ytterligare in vitro-analyser efter 2 dagar.
Figur 1. Exempel på genomförda bygga formar (se steg 1.5).
Figur 2. Ett stelnat myoblast-innehållande vävnad konstruera [1].
Figur 3. H & E färgade snitt av en myoblast-innehållande vävnad konstruktion. "A" visar ett längdsnitt och "B" visar ett tvärsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De formar i vilka vävnaden bygga kommer att kastas kan göras i någon form och storlek, men det måste finnas minst två fästpunkter. Annars matrisen och cellerna bildar en sfärisk struktur och cellerna dör. I det nuvarande protokollet beskriver vi användandet av en polyester mesh för detta ändamål, men vi har även framgångsrikt använt rostfritt stål. Självklart kommer större formar kräver mer celler och en större volym av de andra ingredienserna. Vid formarna är det viktigt att minimera mängden av silikon lim som används och se till att det ligger i själva ändarna av slangen. Detta beror myoblasts nära limmet brukar inte vara lönsam, även efter flera dagars härdning. Dessutom är det klokt att platta det myoblasts för endast en dag eller två innan förbereder vävnaden konstruktioner som förorenar fibroblaster kommer att föröka sig snabbt och så småningom överväldiga myogenic delar av kulturen. Likaså bör myoblasts inte vara klädd tätt eftersom cellerna i kontakt med varandra börjar att smälta och differentierar till myotubes. När det gäller tillverkningen av vävnaden konstruktioner, det finns ett antal kommersiellt tillgängliga källor av typ 1-kollagen, men varje påvisa skillnader i graden av stelning och samstämmigheten i slutprodukten. Dessutom är det viktigt att kollagen preparatet inte bestrålas med UV-ljus eftersom denna process hämmar gelation processen. I våra händer, konstruerar ändra färg från mörkt rosa till en ljusrosa under stelning. Slutligen är vår kollagen förberedelse syra-solublized (inte pepsin smält), så pH i blandningen i steg 3,5 måste ökas genom att lägga NaHCO 3 innan vi bygger in i cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén vid barnsjukhuset Boston.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av forskningsanslag från National Institutes of Health (HL068915, HL088206), en ny forskare Award från Thrasher Research Fund, och bidrag till hjärtöverledning fonden vid barnsjukhuset Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
