Summary
הנה, אנחנו מדגימים ייצור של קולגן מבוסס, רקמה בונה המכיל myoblasts השלד. 3-D אלה בונה מהונדסים עשויים לשמש כדי להחליף או לתקן רקמות
Abstract
למרות העובדה כי קוצבי אלקטרוניים הם מצילי חיים מכשור רפואי, ביצועים לטווח ארוך שלהם מטופלים ילדים יכול להיות בעייתי בשל מגבלות שהוטלו על ידי גודלו הקטן של הילד הצמיחה הבלתי נמנעת שלהם. כתוצאה מכך, קיים צורך אמיתי עבור טיפולים חדשניים שעוצבו במיוחד עבור מטופלים ילדים עם הפרעות קצב לב. אנו מציעים אלטרנטיבה ביולוגית מוליך המורכב מטריצה מבוסס קולגן המכיל autologously הנגזרות תאים יכול להתאים טוב יותר לצמיחה, להפחית את הצורך בניתוחים חוזרים, וגם לשפר באופן משמעותי את איכות החיים של חולים אלו. במחקר הנוכחי, אנו מתארים תהליך לשילוב העיקרי שלד התא תרבויות myoblast בתוך מטריצה הידרוג לאופנה מבנה הרקמה בניתוח מושתלת אשר ישמש כצינור חשמלי בין לתאי העליון והתחתון של הלב. בסופו של דבר, אנו צופים באמצעות סוג זה של רקמות מהונדסות כדי לשחזר הולכה חשמלית בין העליות והחדרים בילדים עם חסם לב מלא. לאור זאת, אנו לבודד myoblasts מן שרירי השלד של הילוד חולדות לואיס אותם על צלחת laminin מצופה תרבות מנות רקמות באמצעות גירסה שונה של פרוטוקולים הוקמה
Protocol
חלק 1: להרכיב לבנות תבניות יציקה
- השתמש סכין גילוח לקצץ בחצי את צינורות סיליקון (VWR) ופצע אותו לתוך חתיכות 3 ס"מ.
- מניחים ירידה של השתל כיתה RTV סיליקון דבק (Rhodia) על החלק הפנימי של צד של הצינור.
- המקום במהירות חתיכה קטנה (1 ס"מ X 1 ס"מ) של רשת פוליאסטר (מקמאסטר-קאר) על טיפת דבק סיליקון ליישר אותו עם סוף בצינור. זה יספק משטח מורם מעט ושטוח על הקובץ המצורף לבנות. חזור על הפעולה עבור הקצה השני.
- אפשר לעצב את לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 3 ימים. זה מועיל כדי להפוך 2-30 תבניות בו זמנית, כמו אלה הם חד פעמי במהותו.
- לאחר דבק יבש לחלוטין, חנות אלה תבניות בכוס מלא אתנול 70% עד שהם נחוצים. צעד זה יעזור לעקר את תבניות המוצר המוגמר מוצג באיור 1.
חלק 2: הכנה בידוד תא myoblast
- מדולל 1 מ"ג Laminin (Sigma) ב 250 מ"ל 0.22 מיקרומטר פילטר מעוקרים פוספט בופר סליין (PBS) המכילה 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen) ו Fungizone 1% (Invitrogen).
- 150 מ"מ רקמת סמל תרבות צלחות (BD Falcon) עם 4 מ"ל של הפתרון Laminin בדילול משלב 1.1 ו דגירה ב-C º 37 במשך 4 שעות לפחות לפני ציפוי myoblasts השלד הראשוני.
- הפוך את המדיום myoblast ידי ערבוב F-10 של הם תערובת מזין (סיגמא) עם FBS 20% (אטלנטה הביולוגיים), 5 ng / L פיברובלסטים בסיסי גורם הגדילה (Promega), 1% פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen), ו Fungizone 1% ( Invitrogen).
- הכן את הפתרון העיכול שריר השלד ידי המסת 1 גרם של ~ 295 U / מ"ג collagenase 2 (וורטינגטון) ב 100 מ"ל 2.4 U / mL Dispase-2 (Roche). הוסף 0.037 גרם CaCl 2 ומערבבים היטב. סנן לעקר את החיץ העיכול באמצעות דיסק 0.2 מיקרומטר לסנן מצויד על מזרק 10 מ"ל ו aliquots חנות ב -20 ° C. מניחים את הסכום הדרוש לעיכול רקמת בשעה 37 ° C יחד עם התקשורת myoblast.
חלק 3: בידוד Myoblast של שריר השלד
- בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, להסיר את השרירים paraspinal מן היילודים עכברושים מתים לואיס על ידי חיתוך לאורך הגב לאורך עמוד השדרה, לקלף את העור ואת השכבות fascia ואז מוציא את השרירים.
- במנדף בתרבית רקמה, מקום השרירים נכרת בצינור חרוטי 50 מ"ל (BD פלקון) מלאות 40 מ"ל הפתרון הנקס סולט 1X מאוזן (HBSS) (Invitrogen) על קרח. אפשר רצועות שריר להתיישב אל החלק התחתון של הצינור בזהירות להסיר את רוב שרידי נוזל הדם על ידי שאיבה עם ואקום סטרילית פיפטה פסטר במנדף תרבות (בייקר).
- יוצקים את פיסות שריר שנקטפו על צלחת תרבות 150 מ"מ להסיר כמה שיותר נוזלים הנותרים ככל האפשר עם יניקה. שימוש 2 יחיד פיפיות סכיני גילוח לקצץ את הרקמה להדביק עבה. יוצקים מראש חימם פתרון העיכול על להדביק את ולהעביר את התערובת צינור טרי 50 מ"ל בעזרת פיפטה 10 מ"ל. במהלך עיכול אנזימטי, הרקמה triturated מדי פעם (ללא מבעבע) עם פיפטה 10 מ"ל מצויד על אלחוטי פיפטה-Aid (דראמונד). שוב, לאפשר לרקמות להתיישב ולהסיר את נוזל עודף.
- מניחים את הצינור על פלטפורמת נדנדה ולעכל ב-C º 37 דקות בערך 30.
- לאחר השריר נוזלי, להעביר את הפתרון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר (BD Falcon) ו צנטריפוגות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 600 XG (Beckman GP). בעזרת פיפטה פסטר יניקה, להסיר כמה שיותר הנוזל ככל האפשר resuspend גלולה עם 10 מ"ל של מדיום myoblast חם.
- טרום צלחת התאים על צלחת ציפוי 150 ברקמת התרבות מ"מ במשך 15 דקות כדי לסייע להסיר fibroblasts.
- העברת התאים לא מחוברים עדיין cultureware laminin מצופים ו לדלל כך יש אחד על כל צלחת 1-2 גורי חולדה. מניחים את הצלחת להגדיר חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO 2.
חלק 4: יציקה בונה רקמות מהונדסות (5 מ"ל)
- לאחר 1-2 ימים, להסיר 10 של 150 מ"מ myoblast רקמות צלחות תרבות מן האינקובטור, לשטוף אותם פעמיים עם 37 ° C 1X PBS, ולהוסיף 4 מ"ל של חם 0.05% טריפסין-EDTA על כל צלחת. החזר את הצלחות אל האינקובטור דקות 5.
- קציר myoblasts מנותקת צלחות למכסה המנוע תרבות לאסוף את הנוזל בתוך שפופרת 50 מ"ל (BD פלקון). השתמש 10 מ"ל של מדיום myoblast לשטוף את כל הצלחות לשלב הזה עם התאים בצינור צנטריפוגות. גלולה התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ב 600 XG (Beckman GP) ולהסיר נוזל עודף כפי שמתואר בשלב 3.5.
- Resuspend התאים myoblast ב 1.6 מ"ל של מדיום myoblast ומניחים על קרח.
- בעזרת מלקחיים, להסיר בזהירות 4 תבניות לבנות משלב 1.5 ולשטוף אותם פעמיים עם 1X PBS. אבק שאיבה את כל עקבות של PBS עם פיפטה פסטר לפני הצבת כל עובש 6-היטב מ"ק רקמהlture צלחת (BD פלקון).
- אסוף את ריאגנטים אחרים הדרושים להכנת לבנות (F10 חם של 10X, אנטיביוטיקה, קולגן סוג 1 [3.9 מ"ג / מ"ל] [6] Matrigel ™) על קרח ולשמור התקשורת myoblast ב 37 º C. מערבבים 500 μL 10X חם של F10, 100 פניצילין μL / סטרפטומיצין, 100 Fungizone μL, קולגן 1.6 מ"ל, ו - 750 ™ Matrigel μL בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבבים את פתרון עבור 10 שניות באמצעות ה-Mini-Vortexer (VWR) מוגדר 10 ומניחים על קרח.
- לאחר מכן, להוסיף 80 μL של NaHCO 3 ואת השעיית myoblast משלב 3.3 לתערובת משלב 3.5. וורטקס את התערובת כולה במשך 10 שניות ולהחזיר את הצינור לדלי קרח למשך כמה דקות כדי לנקות את הפתרון של בועות.
- בזהירות להפיל את התערובת לתוך תבניות לפני שהוא מתחיל לגבש בעזרת פיפטה 10 מ"ל. עובש בכל תחזיק כ 1 מ"ל של נוזל צמיג. נסו להימנע החדרת בועות אוויר במהלך הליך זה.
- להעביר בזהירות את הצלחת המכיל את בונה יצוק אל האינקובטור. לאחר 30 דקות ~, להסיר את המבנים הקרושה מן החממה בזהירות להוסיף בינוני myoblast כדי לכסות גם כל הרקמה לבנות. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור (איור 2).
חלק 5: תוצאות נציג
כאשר בפרוטוקול זה מבוצע כראוי, לבנות myoblast המכילים רקמות מוכן ב ההשתלה vivo (כלומר כאשר יוסר עובש) או להמשך בניתוחים חוץ גופית לאחר 2 ימים.
באיור 1. דוגמאות של תבניות לבנות הושלמה (ראה שלב 1.5).
איור 2. הקרושה myoblast המכילים רקמות לבנות [1].
איור 3. H & E חלקים של רקמה צבעונית myoblast המכילים לבנות. "A" מתאר בסעיף האורך ו "B" מראה חתך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תבניות בו לבנות רקמות יהיה יצוק יכול להתבצע בכל צורה וגודל, אולם יש צורך לפחות בשתי נקודות של הקובץ המצורף. אחרת, המטריצה ותאי ליצור מבנה כדורי והתאים מתים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתארים את השימוש של רשת פוליאסטר למטרה זו, אך יש לנו גם השתמשו בהצלחה רשת נירוסטה. ברור, תבניות גדולות יותר ידרשו התאים יותר נפח גדול יותר של מרכיבים אחרים. כאשר אתה עושה את תבניות, חשוב לצמצם את כמות סיליקון דבק בשימוש כדי לוודא שהוא ממוקם בקצה מאוד הקצוות של הצינור. הסיבה לכך היא myoblasts ליד דבק לא נוטים להיות בת קיימא, אפילו אחרי כמה ימים של ריפוי. בנוסף, זה נבון הצלחת myoblasts למשך יום או יומיים בלבד לפני הכנת בונה רקמות כמו fibroblasts לזהם יתרבו במהירות ובסופו של דבר להכניע את הרכיבים myogenic של התרבות. באופן דומה, myoblasts לא צריך להיות מצופה בצפיפות כי תאים קשר אחד עם השני יתחיל הפתיל להתמיין myotubes. באשר ייצור של בונה רקמות, ישנם מספר מקורות זמינים מסחרית של קולגן סוג 1, אולם כל להדגים הבדלים בשיעור של התמצקות העקביות של המוצר הסופי. יתר על כן, זה הכרחי כי הכנת קולגן אינו מוקרן עם האור האולטרה סגול כמו תהליך זה מעכב את תהליך gelation. בידיים שלנו, בונה את השינוי צבע ורוד כהה ורוד בהיר במהלך מיצוק. לבסוף, הכנה קולגן שלנו היא חומצה solublized (לא עכלן מעוכל), ולכן ה-pH של התערובת בשלב 3.5 צריכה להיות מוגברת על ידי הוספת NaHCO 3 לפני שילוב תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית החולים לילדים בבוסטון.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקי מחקר מן המכון הלאומי לבריאות (HL068915; HL088206), פרס ניו חוקר מהקרן לחקר Thrasher, ותרומות לקרן הולכה לב בבית החולים לילדים בבוסטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
